基本信息
- 項目名稱：
- H9亞型禽流感病毒快速診斷技術研究
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術論文
- 簡介：
- 禽流感是禽類烈性傳染病之一，家禽在感染H9亞型禽流感病毒，特別當伴有混合感染時，可導致并引起高死亡率及產(chǎn)蛋率嚴重下降。給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。本作品通過建立RT-LAMP反應體系、結果可視化技術研究及臨床應用等試驗，成功地建立了一種H9亞型禽流感病毒的快速檢測方法，極大地所淡了診斷耗時，為該病的早期診斷提供了便利。該方法具有靈敏、簡單、快速、直觀，無需復雜儀器的特點，合適在基層獸醫(yī)中推廣應用。
- 詳細介紹：
- 禽流感是禽類烈性傳染病之一，家禽在感染H9亞型禽流感病毒，特別當伴有混合感染時，可導致并引起高死亡率及產(chǎn)蛋率嚴重下降。給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。本作品通過建立RT-LAMP反應體系、結果可視化技術研究及臨床應用等試驗，成功地建立了一種H9亞型禽流感病毒的快速檢測方法，極大地所淡了診斷耗時，為該病的早期診斷提供了便利。該方法具有靈敏、簡單、快速、直觀，無需復雜儀器的特點，合適在基層獸醫(yī)中推廣應用。 本作品經(jīng)敏感性試驗，確定RT-LAMP方法比RT-PCR方法敏感性的10倍。兩種方法均有很好的特異性。針對109份禽咽喉拭子及泄殖腔拭子的檢測結果表明，RT-LAMP方法檢出率明顯高于PCR方法。 與傳統(tǒng)RT-PCR方法相比，本作品中使用的RT-LAMP方法不僅具有高敏感性，更為重要的是該方法可極大的節(jié)約檢測耗時。傳統(tǒng)RT-PCR需要將樣本RNA反轉錄成cDNA后再應用于檢測，即使在近年使用較多的一步法RT-PCR，也需在反應初期進行約30分鐘的反轉錄步驟。而RT-LAMP只需在反應體系中加入反轉錄酶，即可在等溫條件下一步實現(xiàn)樣本RNA擴增，總反應僅耗時60分鐘，較RT-PCR方法節(jié)省至少90分鐘。 RT-LAMP檢測結果的判定方法主要分為四類，一是利用凝膠電泳觀察“梯形”條帶的生成，二是使用實時濁度儀進行實時監(jiān)測，三是肉眼觀察反應管內(nèi)是否產(chǎn)生白色渾濁，四是應用熒光顯色劑顯色進行判定。但前兩種方法需要特殊試劑與儀器設備，而利用肉眼觀察渾濁度則存在反應管透明度及人為因素等影響結果的判定。目前有較多的RT-LAMP反應使用SYBR Green I 染色劑作為熒光顯色劑，但該熒光顯色劑必須在反應結束后打開反應管加入，因而易造成核酸氣溶膠污染，影響檢測結果的準確性。 本作品中使用鈣黃綠素與錳離子的混合溶液作為熒光指示劑，可通過觀察顏色變化直接判定反應結果。另外，由于整個反應過程和檢視過程中不需要開蓋，較好地避免了因氣溶膠污染而引起假陽性結果。 除上述內(nèi)容外，本作品還有很大的發(fā)展空間，使其更易于基層使用。例如在此基礎之上，使用FTA卡或沸水浴方法快速提取H9亞型禽流感病毒核酸，可節(jié)省樣本前處理時間2-3小時，并且無需有毒有害試劑與低溫高速離心機等儀器，操作簡單。另外，還可對反應試劑的組成與貯存條件進行探究優(yōu)化，建立一套較為完善簡易的H9亞型禽流感診斷試劑盒，推廣至技術、條件相對落后的基層實驗室和養(yǎng)殖場使用。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 禽流感是養(yǎng)禽業(yè)重要傳染病之一，H9亞型禽流感可導致高發(fā)病率和死亡率。仔雞易感染造成死亡，產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋率明顯下降，造成經(jīng)濟損失。項目組期望建立一種能夠快速、精確、簡便，適合基層應用的用于該病的快速診斷方法。 Notomi等發(fā)明了一種新的核酸擴增方法。該方法可在等溫條件下高效擴增靶基因，擁有較高的敏感性及特異性。此外，只需簡單的恒溫設備即可進行檢測，加之簡便的可視化技術使其適合基層推廣應用。
科學性、先進性及獨特之處
- 1、使用含有6條引物的反轉錄環(huán)介導等溫擴增方法對H9亞型禽流感病毒進行檢測，恒溫擴增，無需反轉錄過程，一步反應即可。檢測耗時僅需60分鐘，與傳統(tǒng)檢測方法相比，節(jié)省大量檢測耗時。 2、在檢測反應液中直接加入熒光顯色劑進行實時檢測，或者根據(jù)反應液顏色的變化判定反應與否，簡單直觀。 3、操作簡單，快速簡便，成本較低，適合基層推廣應用。
應用價值和現(xiàn)實意義
- 中國大陸自94年首次分離到H9亞型禽流感病毒后，該病開始廣泛流行，導致高死亡率及產(chǎn)蛋率嚴重下降，對養(yǎng)禽業(yè)造成經(jīng)濟損失。并有關于人感染該病毒的報道。早期診斷是疫病防控的關鍵，因此如能針對發(fā)病禽類進行快速診斷，及時切斷傳染源，就顯得尤為重要。 本作品建立的診斷方法，不僅具有靈敏、簡單、快速、直觀，無需復雜儀器的特點，而且檢測成本較低。此外，若配合簡化的樣本處理方法，將會更加適合在基層獸醫(yī)中推廣應用。
學術論文摘要
- 利用反轉錄環(huán)介導等溫核酸擴增技術（RT-LAMP），建立了一種特異、靈敏、便捷，H9亞型禽流感病毒的檢測方法。該方法使用6條特異引物，在63℃的等溫條件下進行反應，敏感性是RT-PCR方法的10倍。通過對15種H亞型禽流感病毒、新城疫病毒和傳染性支氣管炎病毒的檢測表明，該方法具有良好的特異性。在反應體系中使用鈣黃綠素與錳離子的混合溶液作為熒光指示劑可以用于RT-LAMP結果判定。對109份禽咽喉拭子及泄殖腔拭子臨床樣品進行檢測表明，RT-LAMP方法陽性檢出率高于RT-PCR。 通過該研究，我們獲得了一套較為完整的針對H9亞型禽流感病毒的檢測方法，具有靈敏、簡單、快速、直觀的特點。成本較低，適合基層推廣應用，并有助于該病的早期診斷，便于該病防控。
獲獎情況
- 1、“H9亞型禽流感病毒環(huán)介導溫擴增檢測方法的建立與熒光顯色劑的應用”一文，已于2010年6月被中國科技核心期刊《農(nóng)業(yè)生物技術學報》接受，并于2011年第19卷第1期發(fā)表。 2、“H9亞型禽流感病毒快速診斷技術研究”做為全國91個參展項目之一，參加了2010年9月25日由教育部高教司主辦，大連理工大學承辦的“第三屆全國大學生創(chuàng)新論壇”。
鑒定結果
- 無
參考文獻
- 1、LAMP技術及其在微生物檢測中的應用，鞠慧萍等，上海畜牧獸醫(yī)通訊,2010 2、熒光顯色在環(huán)介導等溫擴增（LAMP）檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的應用，張躍偉等，農(nóng)業(yè)生物技術學報,2010 3、環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術的應用研究，劉永生等，中國農(nóng)學通報,2010 4、豬胸膜肺炎放線桿菌環(huán)介導等溫擴增檢測方法的建立與應用，李佳禾等，農(nóng)業(yè)生物技術學報,2009 5、環(huán)介導等溫擴增技術在動物病原檢測中的應用，何玲等，廣東畜牧獸醫(yī)科技,2009 6、環(huán)介導等溫擴增技術在畜禽疾病診斷中的應用，劉寶山等，中國獸醫(yī)雜志,2009
同類課題研究水平概述
- 1、目前國內(nèi)外大量研究均使用SYBR Green I 染色劑作為熒光顯色劑應用于LAMP方法檢測，但該方法存在操作復雜，易造成核酸產(chǎn)物污染的缺點，影響檢測結果的準確性。本研究使用鈣黃綠素與錳離子的混合溶液作為結果指示劑，僅需在反應前加入試劑，通過反應后觀察顏色變化即可判定檢測結果，有效的避免了上述問題。 2、除本作品完成人在中國科技核心期刊《農(nóng)業(yè)生物技術學報》發(fā)表的一篇論文外，國內(nèi)目前未見相關研究報道，該方法在H9禽流感病毒診斷方面還未開始應用。 3、針對H9亞型禽流感病毒，目前國外僅見一篇英文文獻報道——Development of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of H9 avian influenza virus。該文獻中使用4條引物進行反應，且不包含熒光指示劑的應用，診斷過程復雜繁瑣。而本研究使用6條引物進行反應，可大大提高反應效率；加上顯色劑的應用，是檢測結果肉眼可見，極大的縮短了檢測耗時。 4、與目前使用較多的PCR方法相比，該方法省去了單獨的反轉錄過程，且恒溫反應，操作簡便，無需復雜昂貴的設備，同時保證了方法的特異性與敏感性。 5、綜上所述，該方法靈敏、簡單、快速、直觀，適合基層推廣應用，并有助于該病的早期診斷，便于該病防控。
