基本信息
- 項目名稱：
- 上轉(zhuǎn)化納米顆粒發(fā)光技術(shù)在腫瘤治療中的應用研究
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 科技發(fā)明制作A類
- 簡介：
- 上轉(zhuǎn)化熒光成像技術(shù)（upconverting phosphor technology，UPT）是基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料而發(fā)展起來的一種新型標記技術(shù)。上轉(zhuǎn)化顆粒（unconversion particle，UCP）是由數(shù)種稀土金屬元素摻雜于某些晶體的晶格中構(gòu)成的顆粒，這種材料可在紅外光區(qū)被激發(fā)，卻發(fā)射波長遠短于激發(fā)光的可見光。根據(jù)文獻檢索，UPT在生物領(lǐng)域運用都只是在細胞或動物上的簡單嘗試，以證明其可行性及高效優(yōu)越性。 本課題組成功制作的粒徑小于10nm的UCP納米顆粒（UCPnano），經(jīng)物理學檢測，發(fā)光性能良好。本研究擬將UCPnano表面有機化處理，檢測其特性，為其在生物領(lǐng)域的廣泛運用奠定基礎(chǔ)。進一步，用抗血管內(nèi)皮生長因子抗體（anti-VEGF）標記有機化UCPnano，實驗性將UCPnano運用到腫瘤手術(shù)，利用其靶向標定腫瘤組織，顯示腫瘤侵犯邊界和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，以期指導手術(shù)，并為腫瘤綜合治療和預后提供參考，同時為該技術(shù)廣泛運用于腫瘤的診斷、治療提供新的思路。
- 詳細介紹：
- 一、上轉(zhuǎn)化顆粒（upconversion particle，UCP） 上轉(zhuǎn)換熒光成像技術(shù)（up-converting phosphor technology，UPT）是基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料而發(fā)展起來的一種新型標記技術(shù)。UCP是由數(shù)種稀土金屬元素摻雜于某些晶體的晶格中構(gòu)成的顆粒。由于其獨特的結(jié)構(gòu)，這種材料可在紅外光區(qū)（波長>780 nm）被激發(fā)，卻發(fā)射波長遠短于激發(fā)光的可見光（波長為300~750 nm）。 UPT的特點是：抵抗光漂白、無毒、生物相容性好、光化學穩(wěn)定性強、近紅外光激發(fā)對活體組織沒有光損傷、自發(fā)熒光極低幾乎無背景噪音、寬的激發(fā)光譜、窄的發(fā)射光譜、光亮度強、探測靈敏度極高、在生物組織中光穿透深度高，對檢測設(shè)備要求低易于普及推廣。 根據(jù)文獻檢索，UPT在生物領(lǐng)域運用的文章最早始于2001年，截止2008年底，關(guān)于UPT在生物學的運用研究報告僅有6篇，都只是在細胞或動物上的簡單嘗試，以證明其在生物運用上的可行性及其上轉(zhuǎn)換顆粒發(fā)射光的高效優(yōu)越性，這些實驗發(fā)現(xiàn)都證明了上轉(zhuǎn)換熒光成像技術(shù)在生物運用上具有巨大的潛能。 本課題組成功制作的粒徑小于10nm的UCP納米顆粒（UCPnano）。經(jīng)物理學檢測，發(fā)光性能良好，在980nm波下激發(fā)下，發(fā)射波長從300~750nm的任意窄波長的UCP顆粒均已成功制備。目前尚未見文獻有類似報道，該技術(shù)屬國際領(lǐng)先。 二、本課題的設(shè)計思想 由于UCPnano在980nm激發(fā)波長下可以發(fā)出強可見光，因此，如果能將UCPnano有機化包被并加掛特異抗體，則有可能為腫瘤的標記和定位提供極大便利，從而應用于輔助臨床腫瘤的手術(shù)治療。 （1）UCPnano的有機化包被 本研究首先要解決UCPnano的有機親水物包被，擬采用的策略是疊層法（layer-by-layer，LbL）將NH2基團掛到UCPnano上。該方法已經(jīng)成功應用于QD和磁顆粒的有機化包被，屬成熟技術(shù)。 （2）有機化和靶向包被UCPnano標記腫瘤細胞和組織 要將有機物包被后的UCPnano運輸至腫瘤處，需要靶向制劑。本研究選擇單克隆抗體（McAb）作為將UCPnano導向腫瘤的介質(zhì)，實現(xiàn)有機化UCPnano的靶向包被。McAb是利用B細胞雜交瘤技術(shù)獲得的特異性針對某一種抗原決定簇的抗體，具有高度均一性、專一性及穩(wěn)定性的特性。 腫瘤血管的形成與腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移及復發(fā)密切相關(guān)，是影響腫瘤患者預后的重要因素，無血管生成的腫瘤組織不能夠生長成為實體的腫瘤，這是因為新生血管是提供病理組織養(yǎng)分保證其生長增殖的基礎(chǔ)。 血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth-factor，VEGF）被認為是最重要的血管新生相關(guān)因子，VEGF通過刺激內(nèi)皮細胞增殖，增加血管尤其是微小血管的通透性來促進血管形成和新生血管網(wǎng)的建立。 研究表明許多腫瘤存在新生淋巴管，血管內(nèi)皮細胞生長因子C（VEGF-C）、血管內(nèi)皮細胞生長因子D（VEGF-D）及其受體VEGFR-3是重要的促淋巴管生成因子，與腫瘤淋巴管播散轉(zhuǎn)移和預后密切相關(guān)。 由于VEGF在多數(shù)實體腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞中高表達，把抗VEGF單克隆抗體（anti-VEGF）作為靶向引導UCPnano進行特異性腫瘤標記的制劑將具有廣泛的運用價值，同時VEGF家族成員VEGF-C、VEGF-D及其受體VEGF-3與腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，本研究將觀察anti-VEGF在淋巴管和淋巴結(jié)是否也發(fā)揮靶向作用，并評估其在導向UCPnano顯示腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的準確性。 本研究擬選用生物素（biotin，Bt）－親和素(avidin，Av)系統(tǒng)（BAS）將UCPnano顆粒與VEGF偶聯(lián)。它具有親和力高，穩(wěn)定性好，對結(jié)合物的原始生物活性無不良影響，放大作用等特點。 （3）有機化和靶向包被UCPnano標記腫瘤的評價 三步法放免預定位技術(shù)是較為成熟的一種定位方法。具體做法是在注射生物素化單抗后，用avidin結(jié)合標定的單抗并追捕游離單抗加速其排泄，再給予核素標記生物素。此方法中BAS的放大作用可以提高腫瘤內(nèi)放射性核素的攝取量，標記生物素的快速血液清除可保證高瘤/血比。本研究也擬用UCPnano替代放射性核素，運用三步法預定位技術(shù)原理實現(xiàn)腫瘤術(shù)中顯像。 為明確腫瘤范圍，實現(xiàn)有效對照，本研究擬用熒光素酶（firefly luciferase，F(xiàn)Luc）報道質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF-7細胞，篩選穩(wěn)定表達的細胞，注入裸鼠體內(nèi)，建立移植瘤模型。利用熒光素酶和底物的自發(fā)光效應準確顯示腫瘤侵犯區(qū)域和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。 當前基于腫瘤模型對腫瘤研究的主要方法還局限于肉眼觀察、處死實驗動物后的腫瘤體積測量、稱重及組織學切片觀察等。本研究采用的活體動物體內(nèi)生物成像技術(shù)，使研究者可以實時監(jiān)測和記錄在活體中的腫瘤細胞的活性和動向，記錄發(fā)光強度，進行統(tǒng)計學分析，較傳統(tǒng)方法具有顯著的優(yōu)越性。 三、研究內(nèi)容與主要實驗方案 （1）對UCPnano進行有機物包被，制備UCPnano-biotin，檢測其特性。 （2）用生物素（biotin）標記anti-VEGF，鑒定其免疫活性。 （3）用熒光素酶報道質(zhì)粒轉(zhuǎn)染癌細胞，篩選穩(wěn)定表達的細胞，接種裸鼠，建立移植瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型。 （4）將anti-VEGF-biotin與UCPnano-biotin標定在腫瘤細胞上：①在紅外線激發(fā)下在小動物成像儀中檢測、記錄腫瘤范圍；②注入熒光素酶底物，比較腫瘤范圍；③病理檢查。 四、本項目特色與創(chuàng)新之處 1、項目特色 （1）生物技術(shù)研究領(lǐng)域有多種可見光－熒光發(fā)光物質(zhì)標記物，包括熒光蛋白、熒光素酶、量子點以及有機染料如異硫氰酸、羅丹明、Cy3、Cy5等。有機染料和熒光染料具有很多缺點；量子點雖然具有傳統(tǒng)熒光染料無法比擬的熒光特性，但它的生物兼容性及生物安全問題仍局限其廣泛運用。 本課題組成功制作的粒徑小于10nm的UCP納米顆粒（UCPnano），屬國際領(lǐng)先技術(shù)，經(jīng)物理學檢測，發(fā)光性能良好，在980nm波下激發(fā)下，發(fā)射波長從300~750nm的任意窄波長的UCP顆粒均已成功制備，對比文獻，這些均屬國際領(lǐng)先技術(shù)，在生物標記領(lǐng)域有巨大的應用潛力和廣泛的適用范圍。 （2）將anti-VEGF作為靶向制劑，引導UCPnano進行特異性腫瘤標記，不僅可以對腫瘤進行特異性標記，同時有望標記轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)，為進一步觀察淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供參考。 （3）選用生物素-親和素系統(tǒng)（BAS）將UCPnano顆粒與anti-VEGF偶聯(lián)，運用三步法預定位技術(shù)原理實現(xiàn)腫瘤術(shù)中顯像。親和素對生物素的親和力高，穩(wěn)定性好。生物素對結(jié)合物生物活性無不良影響。三步預定位法可以實現(xiàn)多級放大效應，提高術(shù)中可見光強度。 （4）通過文獻查閱我們發(fā)現(xiàn)，在使用熒光染料作為標記物時研究人員并沒有特殊使用靶向制劑，在沒有靶向引導的情況下熒光染料富集于腫瘤組織的原理還不清楚。為此本課題設(shè)置U組，既將有機物包裹的ZrO2-UCPnano-NH2直接靜注到人乳腺癌裸鼠原位移植瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型小鼠中，以明確UCPnano是否也能在腫瘤組織中富集及其光線強度。 2、創(chuàng)新性 （1）目前報道的運用于生物學的UCP顆粒均屬微米顆粒，在生物標記時對靶物質(zhì)的影響較大。本課題組已經(jīng)制作了粒徑小于10nm的UCPnano，物理性能更優(yōu)，對靶物質(zhì)影響更小，對比文獻，屬國際領(lǐng)先技術(shù)。 （2）目前還沒有UCPnano的實用生物學標記技術(shù)，本研究旨在設(shè)計一種普適的方法加工UCPnano，使其不但具有親水性，還能與有機分子結(jié)合，便于生物標記，屬創(chuàng)新研究。 （3）本研究將評價有機物包被后的ZrO2-UCPnano的光學特性、生物安全性，在細胞內(nèi)和動物體內(nèi)成像，并結(jié)合活體生物體內(nèi)成像技術(shù)觀察其在動物體內(nèi)分布、移行及排泄并測定其濃度變化，為其在生物學的廣泛應用奠定基礎(chǔ)。 （4）將可見光標記物應用于腫瘤術(shù)中定位顯像，具有完全自主創(chuàng)新性。 研究發(fā)現(xiàn)熒光染料用于術(shù)中定位，不僅能夠準確顯示腫瘤邊界，而且對于癌前病變和小結(jié)節(jié)的敏感性高于傳統(tǒng)影像學方法。利用熒光染料，可以減少腫瘤殘留、保護正常組織，從而提高患者術(shù)后生存期。 ZrO2-UCPnano在紅外線激發(fā)下可以發(fā)出可見光，且光學性能優(yōu)于熒光染料。將其引入腫瘤手術(shù)，術(shù)者可以用肉眼觀察，避免打擾手術(shù)進程，同時克服了熒光染料的固有缺點。此研究尚未見相關(guān)報道，屬源頭創(chuàng)新。 現(xiàn)有的檢測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的方法前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)（SLNB）操作繁瑣且準確性受到多種因素的影響。在利用熒光染料術(shù)中顯像的研究中缺乏對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)注。本課題探索用anti-VEGF靶向引導UCPnano顯示轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的準確性，也屬創(chuàng)新研究。
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作品專業(yè)信息
設(shè)計、發(fā)明的目的和基本思路、創(chuàng)新點、技術(shù)關(guān)鍵和主要技術(shù)指標
- 一、研究目的 建立上轉(zhuǎn)化納米顆粒（UCPnano）生物標記技術(shù)，評價生物化UCPnano的特性；用其顯示腫瘤邊界，指導手術(shù)，為腫瘤的診斷、治療提供新的技術(shù)手段。 二、研究思路 UCPnano在980nm激發(fā)波長下發(fā)可見光，將其有機化并加掛特異抗體，可為腫瘤標記和定位提供便利，以輔助腫瘤手術(shù)。 三、創(chuàng)新點 目前報道的UCP顆粒屬微米顆粒，本課題組已制作粒徑小于10nm的UCPnano，屬國際領(lǐng)先技術(shù)；目前無UCPnano的實用生物學標記技術(shù)，本研究旨在設(shè)計一普適方法加工UCPnano，屬創(chuàng)新研究；本研究將評價生物化UCPnano的特性，為其在生物學應用奠定基礎(chǔ)；將可見光標記物用于腫瘤定位，具有完全自主創(chuàng)新性。 四、技術(shù)關(guān)鍵 1.UCPnano與腫瘤相關(guān)抗體的生物素化。 2.生物素化UCPnano及腫瘤相關(guān)抗體的性狀評價。 3.UCPnano標記腫瘤在體應用評價。 五、主要技術(shù)指標 1.有機物包被UCPnano，制備UCPnano-biotin，檢測其特性。 2.用生物素（biotin）標記anti-VEGF，鑒定其免疫活性。 3.用熒光素酶報道質(zhì)粒轉(zhuǎn)染癌細胞，篩選穩(wěn)定表達的細胞，接種裸鼠，建立移植瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型。 4.將anti-VEGF-biotin與UCPnano-biotin標定在腫瘤細胞上：①在紅外線激發(fā)下在小動物成像儀中檢測、記錄腫瘤范圍；②注入熒光素酶底物，比較腫瘤范圍；③病理檢查。
科學性、先進性
- 1、上轉(zhuǎn)化發(fā)光技術(shù)（UPT）的優(yōu)點顯示了其很好的生物學應用前景，但目前在生物學的運用研究僅限細胞或動物上簡單嘗試。本課題組成功制作的粒徑小于10nm的UCPnano，屬國際領(lǐng)先技術(shù)。經(jīng)物理學檢測，發(fā)光性能良好，在980nm波下激發(fā)下，發(fā)射波長從300~750nm的任意窄波長的UCP顆粒均已制備，對比文獻，均屬國際領(lǐng)先技術(shù)，在生物標記領(lǐng)域有巨大的應用潛力和廣泛的適用范圍。 2、將anti-VEGF作為靶向制劑，引導UCPnano進行特異性腫瘤標記。VEGF對血管增生活躍的腫瘤組織有特異性。VEGF家族的VEGF-C、VEGF-D及VEGFR-3與腫瘤淋巴管播散轉(zhuǎn)移和預后密切相關(guān)。利用anti-VEGF作為靶向制劑，不僅能對腫瘤進行特異性標記，還有望顯示轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)。 3、選用生物素-親和素系統(tǒng)將UCPnano顆粒與anti-VEGF偶聯(lián)，親和力高，穩(wěn)定性好。運用三步法預定位技術(shù)原理實現(xiàn)腫瘤術(shù)中顯像，具有多級放大效應，保證高瘤/血比，從而提高術(shù)中可見光強度。
獲獎情況及鑒定結(jié)果
- 課題處于實驗研究階段。
作品所處階段
- 實驗研究階段。
技術(shù)轉(zhuǎn)讓方式
- 申請專利后，以專利轉(zhuǎn)讓方式應用推廣。
作品可展示的形式
- 現(xiàn)場演示
使用說明,技術(shù)特點和優(yōu)勢,適應范圍,推廣前景的技術(shù)性說明,市場分析,經(jīng)濟效益預測
- 上轉(zhuǎn)化顆粒在生物學的應用在國際范圍內(nèi)僅有初步應用的報道，所采用的顆粒未達到納米級。本課題的技術(shù)要點是將納米級上轉(zhuǎn)化顆粒進行生物化修飾，使之具備生物兼容性，并評價其特性，為其在生命科學領(lǐng)域的廣泛應用奠定基礎(chǔ)。進而用腫瘤相關(guān)抗體標記生物化修飾后的上轉(zhuǎn)化納米顆粒，實驗性應用于顯示小鼠移植瘤的腫瘤邊界和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，以期指導臨床完整地切除腫瘤組織且最大限度地保護正常組織，并為綜合治療方案和預后提供參考，同時為腫瘤的診斷和治療提供新的技術(shù)手段。 本研究高度創(chuàng)新并具有很好的實用價值；該技術(shù)不僅可以應用于臨床，也可以廣泛應用生命科學基礎(chǔ)研究，具有極好的推廣前景。
同類課題研究水平概述
- 1、腫瘤的手術(shù)治療 手術(shù)切除是惡性腫瘤根治性治療的最重要手段，在術(shù)中準確判斷腫瘤侵犯范圍和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有重要意義。 術(shù)中冰凍切片是目前使用廣泛的術(shù)中病理診斷方法，但需等待時間長，結(jié)果受病理醫(yī)生的經(jīng)驗影響大，且部分組織不宜做冰凍切片。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響手術(shù)治療預后的重要因素，但不易識別。前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)是目前預測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的常用方法，但它操作耗時，在淋巴結(jié)跳躍式轉(zhuǎn)移時受限。 有報道用氨基乙酰丙酸熒光導向顯微手術(shù)切除膠質(zhì)瘤能減少腫瘤殘留并提高患者生存期。另有用吲哚青綠熒光染料引導肝癌的切除，術(shù)后病理證實術(shù)中熒光邊界與病理邊界相一致。用熒光引導腫瘤切除使術(shù)者易于觀察腫瘤邊界，不足是需借助儀器觀察，且熒光物質(zhì)固有缺點限制其運用。 2、目前常用的發(fā)光標記物 生物技術(shù)研究領(lǐng)域現(xiàn)有可見光－熒光發(fā)光物質(zhì)標記物包括熒光蛋白、熒光素酶、量子點以及有機染料。 綠熒光蛋白（GFP）是最常用的熒光蛋白，但其需激發(fā)光才能發(fā)熒光，而且綠色熒光在活體內(nèi)穿透性較差。有研究將含紅熒光蛋白DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染癌細胞，注入小鼠皮下制作轉(zhuǎn)移瘤模型，觀察到隨時間推移出現(xiàn)的腫瘤增長和轉(zhuǎn)移。量子點（QD）技術(shù)是近年發(fā)展的熒光標記技術(shù)，具有傳統(tǒng)熒光染料無法比擬的優(yōu)點，在生物技術(shù)領(lǐng)域?qū)⑵渥鳛樘结樣袕V泛的應用。有報道將其用于腫瘤血管體內(nèi)顯影和顯示腦膠質(zhì)瘤的范圍。QD局限性是具有背景自發(fā)熒光干擾、活體組織光損傷、生物兼容性相對差等。 3、上轉(zhuǎn)化顆粒（UCP）的發(fā)光特點 上轉(zhuǎn)換熒光成像技術(shù)（UPT）是基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料發(fā)展的一種新型標記技術(shù)。UPT有光亮度強、穩(wěn)定性好、對活體組織無光損傷、探測靈敏度極高、在生物組織中穿透性好等特點。據(jù)文獻檢索，UPT在生物學的運用研究報道僅限細胞或動物上的簡單嘗試，以證明其在生物運用上的可行性及發(fā)射熒光的優(yōu)越性，這些實驗都證明了UPT在生物運用上具有巨大的潛能。 4、上轉(zhuǎn)化納米顆粒（UCPnano） 本課題組與某大學激光應用研究所合作，研究UPT在生物學的應用。對比文獻，本課題組制作的粒徑小于10nm的UCPnano，經(jīng)檢測，發(fā)光性能良好，在980nm波下激發(fā)下，發(fā)射波長從300-750nm的任意窄波長的UCPnano均已成功制備。目前尚未見文獻有類似報道，屬國際領(lǐng)先。
