基本信息
- 項目名稱：
- 利用接頭插入技術(shù)構(gòu)建環(huán)型T載體（pYCQ1）
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術(shù)論文
- 簡介：
- 試驗巧妙利用Ⅲ型核酸內(nèi)切酶XcmⅠ的酶切特點，設計了含有3′ 突出 A末端的接頭（接頭中含有2個串聯(lián)的XcmⅠ酶切位點）。通過接頭與pMD18–T載體的連接與連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，得到了可復制的重組載體（pYCQ1）。利用XcmⅠ對pYCQ1進行充分酶切便能得到T載體。整個制備過程簡單便捷，省時省力。
- 詳細介紹：
- 人工設計接頭序列，其特點為含有3′ 突出 A末端，同時人工接頭序列內(nèi)部含有XcmⅠ、Bsp M901、AceⅡ酶切位點。利用人工接頭3′ 突出 A與線性的pMD18–T載體的3′ 突出T連接，將線性的pMD18–T載體改造成環(huán)形具有自身復制功能的pYCQ1載體，降低了實驗室使用T載體的成本，同時增加了載體的克隆位點。 當利用pYCQ1制備T載體時，只需要用XcmⅠ酶切（XcmⅠ限制性片段具有3′ T末端）pYCQ1載體可以得到線性的3′ T粘性末端的pYCQ1-Ｔ載體。實驗驗證，pYCQ1載體可以在受體菌E.coli DH5α中進行大量自我復制，pYCQ1–T載體能夠克隆1800bp的外源PCR產(chǎn)物。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：將線性pMD18-T載體改造成環(huán)型可復制的質(zhì)粒載體，降低實驗室使用T載體的成本，同時增加載體酶切位點數(shù)目。 思路：人工設計含有3′突出A末端的接頭序列，利用人工接頭3′突出A與線性的pMD18-T載體的3′突出T連接，形成重組載體。利用重組載體作為T載體時，用XcmⅠ酶切（XcmⅠ限制性片段有3′T末端）pYCQ1載體可以得到線性的3′T粘性末端的pYCQ1-T載體。
科學性、先進性及獨特之處
- 本研究所做工作為國家自然科學基金項目(30871566)、黑龍江省自然科學基金項目(C2007-37)中內(nèi)容之一。由于在上述項目中有較多需測序的地方，本研究的完成大大降低T載體使用成本，節(jié)省了科研經(jīng)費。本研究的先進性在于構(gòu)建了可復制的前載體（環(huán)型質(zhì)粒），制備T載體時不需人工合成3′T堿基。只需對提取的前載體進行XcmⅠ的酶切就可得到。整個制備過程簡單省錢，得到的T載體高效。屬國內(nèi)先進水平。
應用價值和現(xiàn)實意義
- （1）本研究所改造的質(zhì)粒載體pYCQ1既可以用來制備T載體，還能做為一般的克隆載體來使用。 （2）當利用pYCQ1載體制備pYCQ1-T載體時，我們只需將質(zhì)粒進行XcmⅠ酶切及目的片段的回收。操作簡單，且得到的T載體克隆效率較高，能夠連接較長的PCR產(chǎn)物。 （3）pYCQ1載體的成功構(gòu)建大大降低了實驗室使用T載體的成本，在許多需要測序的試驗中節(jié)省了較多科研經(jīng)費。
學術(shù)論文摘要
- 人工設計接頭序列，其特點為含有3′突出A末端，同時人工接頭序列內(nèi)部含有XcmⅠ、Bsp M901、AceⅡ酶切位點。利用人工接頭3′突出A與線性的pMD18-T載體的3′突出T連接，將線性的pMD18-T載體改造成環(huán)形具有自身復制功能的pYCQ1載體，降低了實驗室使用T載體的成本，同時增加了載體的克隆位點。利用pYCQ1作為T載體時，用XcmⅠ酶切（XcmⅠ限制性片段具有3′T末端）pYCQ1載體可以得到線性的3′T粘性末端的pYCQ1-T載體。實驗驗證，pYCQ1載體可以在受體菌E.coli DH5α中進行大量自我復制，pYCQ1-T載體能夠克隆1 800 bp的外源PCR產(chǎn)物。
獲獎情況
- 已投稿的文章： 楊成泉等：《利用接頭插入技術(shù)構(gòu)建環(huán)型 T載體（pYCQ1）》，已被《黑龍江大學自然科學學報》接收。
鑒定結(jié)果
- 該三位同學試驗設計嚴謹，試驗方法得當，試驗數(shù)據(jù)真實可靠。達到預期結(jié)果。
參考文獻
- [1] James M C. Novel non-templated nucleotide addition reactions catalyzed by procaryotic and eucaryotic DNA polymerases[J]. Nucleic Acid Res, 1988, 16, 9677-9686. [2] 陳 波.一種簡單高效的5′ 突出末端平端化方法[J].生物技術(shù),2007, 17(3): 38-39. [3] 董 玲, 陳創(chuàng)夫, 韓亞杰,等. Klenow大片段聚合酶及T4DNA聚合酶在構(gòu)建重組質(zhì)粒中的應用[J]. 石河子大學學報, 2006, 24(2): 170-172. [4] Cha J, Bishsi W, Chandrasegaran S, et al. New vectors for direct cloning of PCR products[J]. Gene, 1993, 136:369-370. [5] Dagert M, Enrlich S D. Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia colicells[J]. Gene, 1979, 6(1): 23-28. [6] Sambrook J, Fritsch E F, Maniats T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual[M]. 2nd. Beijing: Science Press, 2003.
同類課題研究水平概述
- 自上世紀90年代PCR技術(shù)廣范應用至今，T載體的制備技術(shù)一直是一個熱門話題。迄今為止，已經(jīng)有兩類制備T載體的技術(shù)被認為是能夠制備出具有高效連接效率的T載體： （1）在線性化平末端載體的3′末端加上一個T，制備T載體。 該技術(shù)出現(xiàn)較早，現(xiàn)在大部分商品化T載體都是基于此制備的。1990年Marchuk等人將載體切出平末端，在缺乏dATP 及存在過量dTTP的情況下，用Taq DNA聚合酶的核酸轉(zhuǎn)移酶活性催化，在3′末端加上一個dT，得到了T載體。同年，Holton等人由Sanger的DNA測序原理得到啟發(fā)，用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TDT) 在線性化載體的3′末端加上雙脫氧胸腺嘧啶核苷酸(ddTTP)，也得到了T載體。自此，各國科學家在近20年的時間里基于上述原理不斷進行改進與優(yōu)化，獲得了各種質(zhì)粒的T載體形式。而在改進的過程中，線性化載體的形式漸漸地由平末端的載體轉(zhuǎn)向3′突出的粘性末端載體。2008年，中國農(nóng)業(yè)科學院武曉麗進一步優(yōu)化了該技術(shù)：利用PstI 充分酶切純化的質(zhì)粒pUC19，再用T4 DNA聚合酶消化15min，然后電泳、凝膠回收獲得T載體，試驗中對自制T載體的功能驗證表明：該載體自連率低，假陽性低。 （2）構(gòu)建用于制備T載體的前載體，利用酶切前載體的方法獲得T載體。 該技術(shù)起步較晚，許多國內(nèi)實驗室基于此構(gòu)建載體并申請了專利。該技術(shù)的核心是利用一些Ⅲ型核酸內(nèi)切酶特異識別位點對前載體酶切，從而得到線性T載體。而在構(gòu)建前載體時，應選用一個合適的篩選系統(tǒng)?，F(xiàn)在已報道的篩選系統(tǒng)有：藍白篩選系統(tǒng)、甘露聚糖水解酶（水解圈）篩選系統(tǒng)、毒素蛋白致死篩選系統(tǒng)與溫度敏感致死篩選系統(tǒng)等。除了藍白篩選系統(tǒng)外，其他篩選系統(tǒng)均為近5年內(nèi)完成構(gòu)建工作的。2004年，Han Geun Kim等利用XcmⅠ對pTOC載體進行酶切得到了pTOC-T載體，該T載體基于ParE毒素蛋白表達致死系統(tǒng)，進行陽性克隆子篩選。重組載體可以在較多大腸桿菌菌株細胞內(nèi)復制。2005年，馬洪等構(gòu)建了質(zhì)粒pMD-18Tman2XcmI。用XcmI酶切質(zhì)粒pMD-18Tman2XcmI可以制備T載體。該T載體基于甘露聚糖水解酶（水解圈）篩選系統(tǒng)，進行陽性克隆子篩選。2009年西南大學的馬越等構(gòu)建了基于溫度敏感致死篩選系統(tǒng)的T載體。文中提到，轉(zhuǎn)化得到重組子均為陽性。
