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基本信息

項(xiàng)目名稱(chēng)：
定點(diǎn)誘變抗菌肽（Protegrin）基因的研究
小類(lèi)：
生命科學(xué)
簡(jiǎn)介：
本研究根據(jù)已報(bào)道的Protegrin基因序列設(shè)計(jì)了3’端互補(bǔ)的引物，在引物中引入突變位點(diǎn)，利用拼接PCR方法，擴(kuò)增獲得定點(diǎn)誘變的突變體基因pg-g，利用表達(dá)載體pET-28a將突變基因pg-g轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的抑菌效果有明顯提高。
詳細(xì)介紹：
隨著抗生素的廣泛和長(zhǎng)期使用，耐藥性微生物的不斷產(chǎn)生和擴(kuò)展使得對(duì)感染性疾病的控制變得更加艱難，全新的抗生素研究成為當(dāng)前許多醫(yī)藥專(zhuān)家的主攻目標(biāo)。在近幾年的研究中，人們發(fā)現(xiàn)一類(lèi)短的多肽類(lèi)物質(zhì)——抗菌肽對(duì)各種細(xì)菌能產(chǎn)生較強(qiáng)的殺滅作用，且能抑制分支桿菌、螺旋體、披膜病毒、寄生蟲(chóng)等多種病原生物。除此以外，抗菌肽還具有抗腫瘤的特性；在免疫反應(yīng)過(guò)程中還起著調(diào)理素的作用。 Protegrin是Cathelicidins家族中的一種富含堿性氨基酸的陽(yáng)離子小肽，僅含有16-18個(gè)氨基酸，具有廣譜的抗菌活性及獨(dú)特的抗人類(lèi)HIV病毒的生物學(xué)功能。其抑菌機(jī)制主要是依賴(lài)帶正電荷的精氨酸與靶菌表面的帶負(fù)電荷的位點(diǎn)結(jié)合，通過(guò)Protegrin分子的兩性結(jié)構(gòu)插入細(xì)胞膜中，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮抑菌作用。Protegrin是目前國(guó)際上研究得比較深入的抗菌肽之一，其研究主要集中Protegrin抗菌肽及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的作用機(jī)制和開(kāi)發(fā)應(yīng)用方面，而國(guó)內(nèi)還沒(méi)有對(duì)其的相關(guān)報(bào)道。根據(jù)已有研究結(jié)果表明，抗菌肽Protegrin是一種非常有應(yīng)用價(jià)值和開(kāi)發(fā)前途的新型抗菌物質(zhì)。 天然提取的抗菌肽直接在實(shí)際中應(yīng)用效果往往不很理想，因此人們常常對(duì)抗菌肽進(jìn)行一定程度上的人工改造，以適應(yīng)生產(chǎn)生活的應(yīng)用。目前對(duì)于抗菌肽的開(kāi)發(fā)大都是采用人工合成的方法，成本高且不能完全保證合成單一的純肽。我們通過(guò)對(duì)抗菌肽Protegrin的氨基酸組成和作用機(jī)理分析，并根據(jù)已報(bào)道的Protegrin基因序列設(shè)計(jì)了3’端互補(bǔ)的引物，利用拼接PCR擴(kuò)增獲得定點(diǎn)誘變的突變體基因pg-g，其編碼蛋白的C末端相對(duì)于野生型增加一個(gè)非極性氨基酸Gly，整個(gè)分子的兩性結(jié)構(gòu)有所提高，分子跨膜能力也應(yīng)相應(yīng)增強(qiáng)。利用表達(dá)載體pET-28a將突變體基因pg-g轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)表明目的蛋白得到成功表達(dá)。通過(guò)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，定點(diǎn)突變基因pg-g表達(dá)產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的抑菌效果有明顯提高。

作品專(zhuān)業(yè)信息

撰寫(xiě)目的和基本思路

抗菌肽Protegrin具有廣譜的抗細(xì)菌、真菌及HIV病毒特性。目前針對(duì)Protegrin的研究在國(guó)際上已成為熱點(diǎn)，而國(guó)內(nèi)還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。因此，本文對(duì)Protegrin基因進(jìn)行了初步誘變改良研究。 本研究對(duì)Protegrin基因進(jìn)行定點(diǎn)誘變、在工程菌中高效表達(dá)，最終獲得抑菌效果更加明顯的突變基因。本研究成果為了解抗菌肽結(jié)構(gòu)功能關(guān)系與研發(fā)抑菌效果更好的抗菌肽制品提供了理論依據(jù)。

科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處

1.獲得Protegrin新型突變基因，其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌具有更加明顯抑制作用。 2.目前抗菌肽研究普遍采用直接人工合成方法。本研究對(duì)Protegrin基因采用PCR定點(diǎn)突變、工程菌中誘導(dǎo)表達(dá)，獲得改良抗菌肽。與人工合成方法相比更為省時(shí)簡(jiǎn)便，使得利用微生物法大規(guī)模生產(chǎn)該類(lèi)抗菌肽成為可能。 3.對(duì)Protegrin基因誘變方法采用了拼接PCR法，實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)單、省時(shí)、成本低廉而且準(zhǔn)確性更高。

應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義

1．通過(guò)對(duì)突變型和野生型抗菌肽的抑菌功能研究，可以探究抗菌肽發(fā)揮作用的機(jī)理，更加清晰地了解抗菌肽結(jié)構(gòu)和功能間的內(nèi)在關(guān)系，為抗菌肽新藥物的研發(fā)和臨床應(yīng)用打下理論基礎(chǔ)。 2．獲得抑菌效果增強(qiáng)的改良Protegrin基因，并摸索出在工程菌高效表達(dá)的條件，為最終實(shí)現(xiàn)該類(lèi)抗菌肽的微生物大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。 3．摸索出一條Protegrin抗菌肽研究的新方法，操作更為簡(jiǎn)便，更貼近于實(shí)際應(yīng)用。

學(xué)術(shù)論文摘要

本研究通過(guò)對(duì)抗菌肽Protegrin成熟肽的氨基酸組成和作用機(jī)理分析，并根據(jù)已報(bào)道的Protegrin基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增獲得定點(diǎn)誘變的突變體基因pg-g，其編碼蛋白的末端相對(duì)于野生型增加一個(gè)非極性氨基酸Gly。利用表達(dá)載體pET-28a將突變體基因pg-g轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)表明目的蛋白得到成功表達(dá)。通過(guò)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，定點(diǎn)突變基因pg-g表達(dá)產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的抑菌效果有明顯提高。

獲獎(jiǎng)情況

本研究論文擬發(fā)表在中文核心期刊《河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）》2009年33卷第四期（已接受排版，于7月正式發(fā)表）。

鑒定結(jié)果

無(wú)

參考文獻(xiàn)

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同類(lèi)課題研究水平概述

抗菌肽對(duì)各種細(xì)菌都能產(chǎn)生較強(qiáng)的殺滅作用，且能抑制分支桿菌、螺旋體、披膜病毒、寄生蟲(chóng)等多種病原生物。研究也發(fā)現(xiàn)，抗菌肽附著在細(xì)菌表面后，除了本身對(duì)細(xì)菌的損傷外，還可以使細(xì)菌被吞噬細(xì)胞吞噬消化，起到調(diào)理素的作用。除此以外，抗菌肽還選擇殺傷腫瘤細(xì)胞，具有抗癌抗腫瘤的特性。天然提取的抗菌肽直接在實(shí)際中應(yīng)用效果往往不很理想，因此人們常常對(duì)抗菌肽進(jìn)行一定程度上的人工改造，以適應(yīng)生產(chǎn)生活的應(yīng)用。 Kim 等根據(jù)天然抗菌肽序列，通過(guò)增減或替換氨基酸的方法設(shè)計(jì)出抗菌肽GGN6 ，可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡， 對(duì)具有耐藥性的乳腺癌細(xì)胞系MCF27 有明顯的毒性作用；王志興等把大麥α-2淀粉酶的信號(hào)肽序列和抗菌肽cecropin B 基因或hhiva A 基因構(gòu)成嵌合基因，并把此基因?qū)腭R鈴薯，結(jié)果加信號(hào)肽序列的cecropin B 轉(zhuǎn)基因植株發(fā)青枯病延遲，病情指數(shù)降低；國(guó)外學(xué)者Sawai等在保留兩親螺旋結(jié)構(gòu)的前提下進(jìn)行單堿基突變，結(jié)果克服了抗菌肽visp irinO1對(duì)紅細(xì)胞的溶血性，并提高了抗菌活性。 目前對(duì)抗菌肽藥物的研究，普遍采用在多肽水平上用人工合成改造的方法對(duì)抗菌肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，達(dá)到改變其抗菌的效果，方法復(fù)雜，成本較高，效果有限，不易進(jìn)行大規(guī)模開(kāi)發(fā)生產(chǎn)。通過(guò)PCR介導(dǎo)定點(diǎn)突變DNA片段可以達(dá)到改造蛋白結(jié)構(gòu)的目的，與人工合成肽的方法相比省時(shí)簡(jiǎn)便，同時(shí)還可為用微生物法大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白提供一定的技術(shù)支持。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)引物互補(bǔ)結(jié)合拼接PCR技術(shù)，對(duì)Protegrins進(jìn)行體外定點(diǎn)突變，最終獲得了抑菌效果明顯增強(qiáng)的改良抗菌肽基因。 相信上述研究成果，將拓寬抗菌肽的應(yīng)用領(lǐng)域，產(chǎn)生明顯的社會(huì)效益，具有廣闊的應(yīng)用前景。
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