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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 中國(guó)林蛙核糖核酸酶基因表達(dá)及抑制細(xì)菌生長(zhǎng)活性的研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 本研究項(xiàng)目利用基因克隆和表達(dá)的方法，以我國(guó)特有生物林蛙的基因組為模版，成功地克隆了兩個(gè)核糖核酸酶基因順序，兩者之間氨基酸順序的差異大約50%。在國(guó)際基因庫(kù)中發(fā)現(xiàn)他們分別與蛙類核糖核酸酶中：onconase和lectin樣酶分別具有76%和84%的順序的相似性。該順序結(jié)果已經(jīng)報(bào)國(guó)際GeneBank(EU384703和EU384704)。進(jìn)一步我們通過誘導(dǎo)表達(dá)，得到了兩個(gè)基因的重組蛋白，初步分離純化后的抑菌試驗(yàn)顯示，我們重組的lectin樣的酶具抑菌作用。而onconase樣的酶不具抑菌作用。
- 詳細(xì)介紹：
- 研究背景： 糖核酸酶A家族是一個(gè)蛋白質(zhì)家族，其成員在氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)以及空間結(jié)構(gòu)上具有不同程度的相似性，因而具有不同程度的酶活性。 近年來，人們陸續(xù)從不同動(dòng)物不同組織中發(fā)現(xiàn)許多種該酶家族的成員，它們除或多或少（或缺）地具有酶活性外，還具有其他的一些活性，如：抗病毒、抗腫瘤、免疫抑制、血管生成以及抑制細(xì)菌生長(zhǎng)等方面的一些特殊的生物學(xué)活性。有關(guān)研究中最引人注目的是onconase，由于其來源的特殊性和抗人類腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的活性，它已成為抗腫瘤藥物的研究重點(diǎn)，目前正在進(jìn)行第Ⅲb期臨床試驗(yàn)。 由于哺乳動(dòng)物核糖核酸酶受到人體內(nèi)抑制劑的作用，因而影響了酶的研究和進(jìn)一步的應(yīng)用。兩棲動(dòng)物來源的酶不受哺乳動(dòng)物抑制劑的作用。因此，形成了一個(gè)熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。 蛙類酶的研究國(guó)外主要集中在美洲豹蛙、牛蛙和日本稻田蛙。已發(fā)現(xiàn)十幾種核糖核酸酶，根據(jù)順序的相似性分為三個(gè)組，即：Onconase、Lectin以及Amphinase組。 本研究項(xiàng)目，利用我國(guó)特有的兩棲動(dòng)物林蛙的基因，研究酶的特殊生物學(xué)活性，目前已經(jīng)克隆和表達(dá)了林蛙的兩個(gè)基因，并對(duì)其抑菌活性進(jìn)行了初步的研究。 方法結(jié)果： 利用基因克隆和表達(dá)的方法，成功得到了兩個(gè)核糖核酸酶基因順序。這兩個(gè)順序均具有該酶家族的保守順序，兩者之間氨基酸順序的差異大約50%。在國(guó)際基因庫(kù)中發(fā)現(xiàn)他們與蛙類核糖核酸酶中：onconase和lectin樣的最相似的酶分別具有76%和84%的順序的相似性。該順序結(jié)果已經(jīng)報(bào)美國(guó)GeneBank（ EU384703和EU384704）。其次，我們得到了重組的酶蛋白，經(jīng)初步分離純化后的抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示：我們重組的lectin樣的酶具抑菌作用；而onconase樣的酶不具抑菌作用。 項(xiàng)目特點(diǎn)： 本項(xiàng)目追蹤了國(guó)際相關(guān)研究的熱點(diǎn)問題，利用了我國(guó)特有的物種基因資源，表達(dá)了林蛙的兩個(gè)核糖核酸酶基因，為進(jìn)一步的應(yīng)用打下了一個(gè)基礎(chǔ)，也彌補(bǔ)了我國(guó)在該領(lǐng)域的空白。 不足及展望： 實(shí)驗(yàn)中，重組lectin樣核糖核酸酶顯示細(xì)胞毒性，給誘導(dǎo)表達(dá)帶來困難。希望經(jīng)進(jìn)一步的研究，使其能夠大量表達(dá)，進(jìn)一步為生物抗菌藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)；Onconase樣的重組酶的抗腫瘤活性研究，也將使我國(guó)在該類抗腫瘤酶的應(yīng)用方面趕超國(guó)際先進(jìn)水平。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 本研究旨在發(fā)現(xiàn)我國(guó)特有兩棲動(dòng)物林蛙的核糖核酸酶的基因及其功能，檢驗(yàn)其抑菌作用，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。 近年來，國(guó)外利用當(dāng)?shù)赝茴愘Y源獲得了多種核糖核酸酶的基因產(chǎn)物。這些酶除具有水解RNA的活性外，還具有一些特殊的生物學(xué)活性，如抗病毒以及抑菌等活性。 本研究以我國(guó)特有生物林蛙為對(duì)象，利用基因克隆和表達(dá)的手段獲得重組蛋白，并對(duì)其抗菌活性進(jìn)行初步測(cè)定，以期發(fā)現(xiàn)具有抗菌活性的林蛙核糖核酸酶。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 利用我國(guó)獨(dú)特基因資源，研究中國(guó)林蛙核糖核酸酶基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)重組蛋白的抑菌作用。成果可望具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)。 追蹤國(guó)際相關(guān)領(lǐng)域的科學(xué)進(jìn)展，其研究成果為本項(xiàng)目提供較好的實(shí)踐和理論支撐。圍繞生物制藥和抑菌的大課題，符合經(jīng)濟(jì)發(fā)展的需要，具有廣闊的應(yīng)用前景。 國(guó)外對(duì)蛙類核糖核酸酶的研究局限在牛蛙，豹蛙和日本稻田蛙；國(guó)內(nèi)林蛙的研究也限于細(xì)胞水平。本項(xiàng)目無疑將給該領(lǐng)域的研究帶來新的內(nèi)容。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 具有抗菌活性的多肽和蛋白質(zhì)生物制劑的出現(xiàn)，給抗菌治療開辟了廣闊的前景。 本實(shí)驗(yàn)通過克隆和基因表達(dá)，探討我國(guó)兩棲動(dòng)物核糖核酸酶抑菌的活性，為進(jìn)一步研究該酶的特殊生物學(xué)活性打下基礎(chǔ)，填補(bǔ)我國(guó)林蛙核糖核酸酶研究的空白；同時(shí)也為林蛙核糖核酸酶應(yīng)用于細(xì)菌性疾病的治療打下基礎(chǔ)。表達(dá)我國(guó)林蛙核糖核酸酶、發(fā)現(xiàn)其抗菌作用，無疑將對(duì)我國(guó)林蛙的基因利用和生物制劑的抗菌研究和應(yīng)用產(chǎn)生一個(gè)新的影響。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 現(xiàn)今抗生素是治療感染性疾病的主要藥物，隨著抗菌藥物過多和過濫的使用，致使細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性增加，療效下降，使抗生素的作用不再像以前那樣有效。具有抗菌活性的多肽和具有抗菌活性的蛋白質(zhì)生物制劑的應(yīng)用將會(huì)為抗菌治療帶來新的更加廣闊的前景。 近年來，越來越多的研究表明，核糖核酸酶（Ribonuclease，RNase）不僅具有消化酶的功能，而且還可作為一種有選擇性的細(xì)胞毒素，具有抗病毒和抑制細(xì)菌等特殊的生物學(xué)功能, 在疾病的診斷和治療方面表現(xiàn)出重要的應(yīng)用價(jià)值。 本課題旨在從林蛙中克隆和表達(dá)具有抑制細(xì)菌活性的核糖核酸酶，并進(jìn)行抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用的研究。本研究從林蛙基因組中，克隆和表達(dá)了2種核糖核酸酶，通過檢索基因文庫(kù)， 發(fā)現(xiàn)它們分別與onconase和lectin樣的核糖核酸酶具有最大的相似性，分別為76%和84%。兩個(gè)順序均保留蛙類核糖核酸酶的保守區(qū)域，而兩者之間氨基酸順序具有大約50%的不同。初步的抑菌試驗(yàn)顯示：其中l(wèi)ectin樣的重組酶具有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的活性，而onconase樣的不具有抑菌活性。
獲獎(jiǎng)情況
- 尚無
鑒定結(jié)果
- 尚無
參考文獻(xiàn)
- [1] W. Ardelt, S.M.Mikulski, K. Shogen. Amino acid sequence of anti-tumor protein from Rana pipiens oocytes and early embryos. J.Biol.Chem. 1991, 266:245-251. [2] YouDi Liao, HueyChung Huang, YinJen Leu, et al. Purification and cloning of cytotoxic ribonucleases from Rana catesbeiana. Nucleic Acids Research. 2000, 28(21): 4097-4104. [3] Torrent G, Rib M, Benito A, Vilanova M. Bactericidal activity engineered on human pancreatic ribonuclease and onconase. Mol. Pharm. 2009 Feb 4. [4] Yang D, Rosenberg HF, Chen Q, et al. Eosinophil-derived neurotoxin (EDN), an antimicrobial protein with chemotactic activities for dendritic cells. Blood. 2003, 102(9):3396-403. [5] Zhang J, Dyer KD, Rosenberg HF. Human RNase 7: a new cationic ribonuclease of the RNase A superfamily. Nucleic Acids Res. 2003, 31(2):602-7. [6] H.F. Rosenberg, Jianzhi Zhang, YouDi Liao, et al. Rapid diversification of RNase A super family ribonucleases from Bullfrog, Rana catesbeiana. J Mol.Evol .2001, 53:31-38.
同類課題研究水平概述
- 核糖核酸酶A超家族（Ribonuclease A superfamily; RNase A superfamily）是由一組結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)構(gòu)成的蛋白質(zhì)家族，它們?cè)诎被釟埢慕M成和空間結(jié)構(gòu)上的相似性決定了它們具有相似的酶活性。最早發(fā)現(xiàn)并深入研究過的牛胰核糖核酸酶就是這一大家族成員的原型。它們共同的酶活性表現(xiàn)為：在組成RNA的核苷酸殘基的3’端水解RNA。這一點(diǎn)提供了我們檢測(cè)RNase酶活性的基本方法。 目前，已經(jīng)有許多核糖核酸酶家族的成員被分離和表達(dá)出來。它們來源于不同的物種，包括哺乳動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物、爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物等，以及同一物種的不同器官，具有不同程度的酶活性和廣泛的生物學(xué)活性，如：抗病毒、抑制細(xì)菌生長(zhǎng)、促進(jìn)血管生成、免疫抑制以及抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等活性，在治療愛滋病、抑制細(xì)菌病毒感染和人類腫瘤治療等臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域具有廣闊的遠(yuǎn)景，已成為當(dāng)前一個(gè)活躍的研究領(lǐng)域。例如，人類基因組中存在有13種核糖核酸酶。其中，嗜酸性粒細(xì)胞來源的神經(jīng)毒素（EDN，RNase2）和堿性蛋白（ECP，RNase3）分別顯示出抑制細(xì)菌和病毒生長(zhǎng)的活性；RNase5被認(rèn)為是血管生成素（angiogenin）；RNase7 顯示出抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的功能。 為了進(jìn)一步證實(shí)某些酶的特殊生物活性，人們?cè)噲D在哺乳動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物中尋找這些酶的對(duì)應(yīng)物（conterparts），結(jié)果發(fā)現(xiàn)：小鼠核糖核酸酶也具有抑制病毒繁殖和抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的功能。 由于哺乳動(dòng)物胎盤來源的核糖核酸酶抑制劑對(duì)哺乳動(dòng)物核糖核酸酶存在普遍的抑制作用，阻礙了酶與其受體的結(jié)合，進(jìn)而抑制了酶的應(yīng)用。因此，兩棲類動(dòng)物來源的酶就成了人們尋找這種可為人類利用的具有細(xì)胞毒性的酶的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。 目前，國(guó)內(nèi)外同類課題的大量文獻(xiàn)，有關(guān)核糖核酸酶的研究沒有涉及中國(guó)林蛙，只是在豹蛙、稻田蛙、和牛蛙中做了相關(guān)的報(bào)道。而其他有關(guān)于林蛙的研究只是關(guān)于抗菌多肽的，沒有在分子水平對(duì)林蛙的核糖核酸酶進(jìn)行如此深入的研究。 現(xiàn)今，國(guó)外有關(guān)核糖核酸酶的抗腫瘤研究已經(jīng)達(dá)到臨床試驗(yàn)階段，這也為核糖核酸酶在抑菌方面的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。縱觀其他人所做的研究發(fā)現(xiàn)：核糖核酸酶家族中的某些成員具有抑菌作用是較為肯定。所以，我們以林蛙核糖核酸酶的抑制細(xì)菌活性的研究，作為研究我國(guó)特有兩棲動(dòng)物特殊生物學(xué)活性的開始。
