基本信息
- 項目名稱：
- 重組腺病毒感染血管組織的條件優(yōu)化與表達效率比較
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術論文
- 簡介：
- 以腺病毒為載體將外源基因導入動物體內的特定組織，是研究靶基因功能、探討其對相關疾病發(fā)生發(fā)展影響的有效手段 ，而選擇最佳條件向組織中導入重組病毒，對于獲取真實的實驗結果至關重要。本研究以大鼠頸總動脈為靶組織，采用不同條件向動脈壁導入重組腺病毒，觀察病毒劑量和感染時間對感染效率和血管完整性的影響，并提供了一個優(yōu)化的感染方案。利用這一優(yōu)化方案，我們在構建了大鼠頸總動脈內皮球囊剝脫模型的基礎上，將KLF4重組腺病毒導入損傷后的頸總動脈，觀察外源性KLF4對血管內膜增生的防治效果。研究發(fā)現，外源性KLF4具有抑制損傷誘導的血管內膜增生的作用。這一結果為進一步研究KLF4在血管再狹窄中的作用提供了實驗依據。本成果所建立的外源基因導入血管組織的方法具有簡便、易行、感染率高、重復性好、效果顯著等特點，已推廣應用于其它相關課題的研究。
- 詳細介紹：
- 以腺病毒為載體將外源基因導入動物體內的特定組織，是研究靶基因功能、探討其對相關疾病發(fā)生發(fā)展影響的有效手段 ，而選擇最佳條件向組織中導入重組病毒，對于獲取真實的實驗結果至關重要。本研究以大鼠頸總動脈為靶組織，采用不同條件向動脈壁導入重組腺病毒，觀察病毒劑量和感染時間對感染效率和血管完整性的影響。將感染病毒分為10ul 、20ul 和40 μl組，每組分別選用10min，20min和30min的感染時間，然后觀察感染效率。經免疫組化染色檢測外源基因的表達產物(以此評價感染效率),發(fā)現重組腺病毒的感染效率具有劑量依賴性和時間依賴性，在不損傷血管壁結構完整性的條件下，以20 μl病毒量感染20 min時的感染效果最佳。本研究結果為以腺病毒為載體將外源基因導入血管組織，研究其在血管再狹窄中的功能提供了一個優(yōu)化的感染方案。利用這一優(yōu)化方案，我們在構建了大鼠頸總動脈內皮球囊剝脫模型的基礎上，將KLF4重組腺病毒導入損傷后的頸總動脈，觀察外源性KLF4對血管內膜增生的防治效果。研究發(fā)現，導入外源性KLF4組內膜增生程度較感染空病毒組明顯減輕，表明外源性KLF4具有抑制損傷誘導的血管內膜增生的作用。這一結果為進一步研究KLF4在血管再狹窄中的作用提供了實驗依據。本成果所建立的外源基因導入血管組織的方法具有簡便、易行、感染率高、重復性好、效果顯著等特點，已推廣應用于其它相關課題的研究。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 以腺病毒為載體將外源基因導入動物體內的特定組織，是研究靶基因功能、探討其對相關疾病發(fā)生發(fā)展影響的有效手段 ，而選擇最佳條件向組織中導入重組病毒，對于獲取真實的實驗結果至關重要。本研究以大鼠頸總動脈為靶組織，觀察病毒劑量和感染時間對感染效率和血管完整性的影響。證實重組腺病毒的感染效率具有劑量依賴性和時間依賴性，在不損傷血管壁結構完整性的條件下，以20μl病毒量感染20min時的感染效果最佳。
科學性、先進性及獨特之處
- 1．本研究首次觀察了病毒劑量、感染時間等因素對感染效率的影響，為制定科學、規(guī)范的外源基因導入方案提供了可靠的數據； 2．優(yōu)化建立了重組腺病毒高效感染血管組織的方法，該方法具有簡便易行、感染率高、重復性好、效果顯著等特點，為研究目標基因在血管再狹窄中的作用及分子機制提供了可行的方法； 3．證明外源性KLF4可抑制損傷誘導的血管新生內膜的形成，為血管再狹窄的藥物研發(fā)提供了分子靶標。
應用價值和現實意義
- 1.本研究所建立的方法已總結為研究論文，將在國內權威期刊《中國老年學雜志》上發(fā)表； 2.該方法被應用于其他相關課題的研究，取得了滿意的結果； 3.該方法可用于研究目標基因在血管重塑性疾病的發(fā)生中所起到的作用及其分子機制，是解決相關理論問題所必需的關鍵技術，在心血管基礎研究中具有應用價值。
學術論文摘要
- 以腺病毒為載體將外源基因導入動物體內的特定組織，是研究靶基因功能、探討其對相關疾病發(fā)生發(fā)展影響的有效手段 ，而選擇最佳條件向組織中導入重組病毒，對于獲取真實的實驗結果至關重要。本研究以大鼠頸總動脈為靶組織，采用不同條件向動脈壁導入重組腺病毒，觀察病毒劑量和感染時間對感染效率和血管完整性的影響，并提供了一個優(yōu)化的感染方案。利用這一優(yōu)化方案，我們在構建了大鼠頸總動脈內皮球囊剝脫模型的基礎上，將KLF4重組腺病毒導入損傷后的頸總動脈，觀察外源性KLF4對血管內膜增生的防治效果。研究發(fā)現，外源性KLF4具有抑制損傷誘導的血管內膜增生的作用。這一結果為進一步研究KLF4在血管再狹窄中的作用提供了實驗依據。本成果所建立的外源基因導入血管組織的方法具有簡便、易行、感染率高、重復性好、效果顯著等特點，已推廣應用于其它相關課題的研究。
獲獎情況
- 發(fā)表論文 1. 田文嘉，李晗，鄭斌，等。重組腺病毒感染血管組織的條件優(yōu)化與表達效率比較。中國老年學雜志，2009，(已錄用，待發(fā)表)； 2．李晗，田文嘉，劉彬，韓梅。不同性別冠心病患者主要危險因素的比較。中國老年學雜志， 2009，29：189-190
鑒定結果
參考文獻
- 1. Liu ZM, Zhang CX, Dronadula N, Li Q, and Rao GN. Blockade of Nuclear Factor of Activated T Cells Activation Signaling Suppresses Balloon Injury-induced Neointima Formation in a Rat Carotid Artery Model. J. Biol. Chem., 2005; 280: 14700 - 14708. 2. Shyu KG, Wang BW, Kuan P, and Chang H. RNA Interference for Discoidin Domain Receptor 2 Attenuates Neointimal Formation in Balloon Injured Rat Carotid Artery. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2008; 28: 1447 – 1453 3. Schillinger M, Exner M, Minar E, Mlekusch W, Müllner M, Mannhalter C, Bach FH, and Wagner O. Heme oxygenase-1 genotype and restenosis after balloon angioplasty: a novel vascular protective factor.J. Am. Coll. Cardiol., 2004; 43: 950 – 957 4. Garl PJ., Wenzlau JM., Walker HA., Whitelock JM., Costell M, and Weiser-Evans MC. Perlecan-Induced Suppression of Smooth Muscle Cell Proliferation Is Mediated Through Increased Activity of the Tumor Suppressor PTEN Circ. Res., 2004; 94: 175 - 183.
同類課題研究水平概述
- 自上世紀80年代以來，基因治療的概念由經典的基因治療擴展到導入外源基因達到治療目的的所有方法。為了將目的基因轉入細胞中，選擇適當的載體是非常關鍵的。常用的有非病毒的質粒、裸DNA、腺病毒(AV)、腺相關病毒和逆轉錄病毒等。 以腺病毒為載體將外源基因導入動物體內的特定組織，是研究靶基因功能、探討其對相關疾病發(fā)生發(fā)展影響的有效手段 ，而選擇最佳條件向組織中導入重組病毒，對于獲取真實的實驗結果至關重要。腺病毒載體的宿主范圍大、轉染效率高、滴度高、安全、較穩(wěn)定、致癌的潛在危險性小,從而在體外基因的轉移中具有很大的優(yōu)勢。本實驗使用改造后的缺陷性AV-pAd/CMV/V5- DEST (刪除了E1和E3基因)，含有巨細胞病毒啟動子，可使目的基因快速、高水平表達，便于復制目的基因及篩選，但是需要在能表達E1基因的293A細胞中包裝、產生、擴增，轉染后在哺乳動物細胞內卻不表達E1a、E1b蛋白且腺病毒基因不整合入宿主的基因組。因此，用pAd/CMV/V5-DEST作為目的基因載體比較安全。利用人腺病毒構建的載體可用于人類疾病的基因治療，原因在于：①腺病毒的36kb雙鏈DNA基因組易于以等級基因技術操作②感染宿主范圍廣③在許可細胞中病毒能有效復制⑤在非許可細胞中，病毒基因組以附加子形式存在，并持續(xù)表達一段時間。這些特點使得其成為應用于基因治療有很大吸引力的候選載體。本研究以大鼠頸總動脈為靶組織，采用不同條件向動脈壁導入重組腺病毒，觀察病毒劑量和感染時間對感染效率和血管完整性的影響并提供了一個優(yōu)化的感染方案。 Krüppel樣因子（Krüppel-like factors，KLFs）是一類含鋅指結構的轉錄因子家族，主要參與調節(jié)細胞發(fā)育、分化、增殖和凋亡等過程。KLF家族中的KLF4高表達于上皮組織中，尤其是終末分化或有絲分裂后的腸上皮細胞，提示它與生長抑制相關。已有研究表明KLF4是一種生長抑制相關基因且它本身是一種細胞增殖抑制因子。為此利用上述優(yōu)化方案，我們在構建了大鼠頸總動脈內皮球囊剝脫模型的基礎上，將KLF4重組腺病毒導入損傷后的頸總動脈，觀察外源性KLF4對血管內膜增生的防治效果。研究發(fā)現，導入外源性KLF4組內膜增生程度較感染空病毒組明顯減輕，表明外源性KLF4具有抑制損傷誘導的血管內膜增生的作用。這一結果為進一步研究KLF4在血管再狹窄中的作用提供了實驗依據
