題-1_100_100.jpg)
基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 重組腺病毒感染血管組織的條件優(yōu)化與表達(dá)效率比較
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 以腺病毒為載體將外源基因?qū)雱?dòng)物體內(nèi)的特定組織，是研究靶基因功能、探討其對(duì)相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展影響的有效手段 ，而選擇最佳條件向組織中導(dǎo)入重組病毒，對(duì)于獲取真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要。本研究以大鼠頸總動(dòng)脈為靶組織，采用不同條件向動(dòng)脈壁導(dǎo)入重組腺病毒，觀察病毒劑量和感染時(shí)間對(duì)感染效率和血管完整性的影響，并提供了一個(gè)優(yōu)化的感染方案。利用這一優(yōu)化方案，我們?cè)跇?gòu)建了大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮球囊剝脫模型的基礎(chǔ)上，將KLF4重組腺病毒導(dǎo)入損傷后的頸總動(dòng)脈，觀察外源性KLF4對(duì)血管內(nèi)膜增生的防治效果。研究發(fā)現(xiàn)，外源性KLF4具有抑制損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生的作用。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究KLF4在血管再狹窄中的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本成果所建立的外源基因?qū)胙芙M織的方法具有簡(jiǎn)便、易行、感染率高、重復(fù)性好、效果顯著等特點(diǎn)，已推廣應(yīng)用于其它相關(guān)課題的研究。
- 詳細(xì)介紹：
- 以腺病毒為載體將外源基因?qū)雱?dòng)物體內(nèi)的特定組織，是研究靶基因功能、探討其對(duì)相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展影響的有效手段 ，而選擇最佳條件向組織中導(dǎo)入重組病毒，對(duì)于獲取真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要。本研究以大鼠頸總動(dòng)脈為靶組織，采用不同條件向動(dòng)脈壁導(dǎo)入重組腺病毒，觀察病毒劑量和感染時(shí)間對(duì)感染效率和血管完整性的影響。將感染病毒分為10ul 、20ul 和40 μl組，每組分別選用10min，20min和30min的感染時(shí)間，然后觀察感染效率。經(jīng)免疫組化染色檢測(cè)外源基因的表達(dá)產(chǎn)物(以此評(píng)價(jià)感染效率),發(fā)現(xiàn)重組腺病毒的感染效率具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性，在不損傷血管壁結(jié)構(gòu)完整性的條件下，以20 μl病毒量感染20 min時(shí)的感染效果最佳。本研究結(jié)果為以腺病毒為載體將外源基因?qū)胙芙M織，研究其在血管再狹窄中的功能提供了一個(gè)優(yōu)化的感染方案。利用這一優(yōu)化方案，我們?cè)跇?gòu)建了大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮球囊剝脫模型的基礎(chǔ)上，將KLF4重組腺病毒導(dǎo)入損傷后的頸總動(dòng)脈，觀察外源性KLF4對(duì)血管內(nèi)膜增生的防治效果。研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入外源性KLF4組內(nèi)膜增生程度較感染空病毒組明顯減輕，表明外源性KLF4具有抑制損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生的作用。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究KLF4在血管再狹窄中的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本成果所建立的外源基因?qū)胙芙M織的方法具有簡(jiǎn)便、易行、感染率高、重復(fù)性好、效果顯著等特點(diǎn)，已推廣應(yīng)用于其它相關(guān)課題的研究。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 以腺病毒為載體將外源基因?qū)雱?dòng)物體內(nèi)的特定組織，是研究靶基因功能、探討其對(duì)相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展影響的有效手段 ，而選擇最佳條件向組織中導(dǎo)入重組病毒，對(duì)于獲取真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要。本研究以大鼠頸總動(dòng)脈為靶組織，觀察病毒劑量和感染時(shí)間對(duì)感染效率和血管完整性的影響。證實(shí)重組腺病毒的感染效率具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性，在不損傷血管壁結(jié)構(gòu)完整性的條件下，以20μl病毒量感染20min時(shí)的感染效果最佳。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 1．本研究首次觀察了病毒劑量、感染時(shí)間等因素對(duì)感染效率的影響，為制定科學(xué)、規(guī)范的外源基因?qū)敕桨柑峁┝丝煽康臄?shù)據(jù)； 2．優(yōu)化建立了重組腺病毒高效感染血管組織的方法，該方法具有簡(jiǎn)便易行、感染率高、重復(fù)性好、效果顯著等特點(diǎn)，為研究目標(biāo)基因在血管再狹窄中的作用及分子機(jī)制提供了可行的方法； 3．證明外源性KLF4可抑制損傷誘導(dǎo)的血管新生內(nèi)膜的形成，為血管再狹窄的藥物研發(fā)提供了分子靶標(biāo)。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 1.本研究所建立的方法已總結(jié)為研究論文，將在國(guó)內(nèi)權(quán)威期刊《中國(guó)老年學(xué)雜志》上發(fā)表； 2.該方法被應(yīng)用于其他相關(guān)課題的研究，取得了滿意的結(jié)果； 3.該方法可用于研究目標(biāo)基因在血管重塑性疾病的發(fā)生中所起到的作用及其分子機(jī)制，是解決相關(guān)理論問題所必需的關(guān)鍵技術(shù)，在心血管基礎(chǔ)研究中具有應(yīng)用價(jià)值。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 以腺病毒為載體將外源基因?qū)雱?dòng)物體內(nèi)的特定組織，是研究靶基因功能、探討其對(duì)相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展影響的有效手段 ，而選擇最佳條件向組織中導(dǎo)入重組病毒，對(duì)于獲取真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要。本研究以大鼠頸總動(dòng)脈為靶組織，采用不同條件向動(dòng)脈壁導(dǎo)入重組腺病毒，觀察病毒劑量和感染時(shí)間對(duì)感染效率和血管完整性的影響，并提供了一個(gè)優(yōu)化的感染方案。利用這一優(yōu)化方案，我們?cè)跇?gòu)建了大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮球囊剝脫模型的基礎(chǔ)上，將KLF4重組腺病毒導(dǎo)入損傷后的頸總動(dòng)脈，觀察外源性KLF4對(duì)血管內(nèi)膜增生的防治效果。研究發(fā)現(xiàn)，外源性KLF4具有抑制損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生的作用。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究KLF4在血管再狹窄中的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本成果所建立的外源基因?qū)胙芙M織的方法具有簡(jiǎn)便、易行、感染率高、重復(fù)性好、效果顯著等特點(diǎn)，已推廣應(yīng)用于其它相關(guān)課題的研究。
獲獎(jiǎng)情況
- 發(fā)表論文 1. 田文嘉，李晗，鄭斌，等。重組腺病毒感染血管組織的條件優(yōu)化與表達(dá)效率比較。中國(guó)老年學(xué)雜志，2009，(已錄用，待發(fā)表)； 2．李晗，田文嘉，劉彬，韓梅。不同性別冠心病患者主要危險(xiǎn)因素的比較。中國(guó)老年學(xué)雜志， 2009，29：189-190
鑒定結(jié)果
參考文獻(xiàn)
- 1. Liu ZM, Zhang CX, Dronadula N, Li Q, and Rao GN. Blockade of Nuclear Factor of Activated T Cells Activation Signaling Suppresses Balloon Injury-induced Neointima Formation in a Rat Carotid Artery Model. J. Biol. Chem., 2005; 280: 14700 - 14708. 2. Shyu KG, Wang BW, Kuan P, and Chang H. RNA Interference for Discoidin Domain Receptor 2 Attenuates Neointimal Formation in Balloon Injured Rat Carotid Artery. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2008; 28: 1447 – 1453 3. Schillinger M, Exner M, Minar E, Mlekusch W, Müllner M, Mannhalter C, Bach FH, and Wagner O. Heme oxygenase-1 genotype and restenosis after balloon angioplasty: a novel vascular protective factor.J. Am. Coll. Cardiol., 2004; 43: 950 – 957 4. Garl PJ., Wenzlau JM., Walker HA., Whitelock JM., Costell M, and Weiser-Evans MC. Perlecan-Induced Suppression of Smooth Muscle Cell Proliferation Is Mediated Through Increased Activity of the Tumor Suppressor PTEN Circ. Res., 2004; 94: 175 - 183.
同類課題研究水平概述
- 自上世紀(jì)80年代以來，基因治療的概念由經(jīng)典的基因治療擴(kuò)展到導(dǎo)入外源基因達(dá)到治療目的的所有方法。為了將目的基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，選擇適當(dāng)?shù)妮d體是非常關(guān)鍵的。常用的有非病毒的質(zhì)粒、裸DNA、腺病毒(AV)、腺相關(guān)病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒等。 以腺病毒為載體將外源基因?qū)雱?dòng)物體內(nèi)的特定組織，是研究靶基因功能、探討其對(duì)相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展影響的有效手段 ，而選擇最佳條件向組織中導(dǎo)入重組病毒，對(duì)于獲取真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要。腺病毒載體的宿主范圍大、轉(zhuǎn)染效率高、滴度高、安全、較穩(wěn)定、致癌的潛在危險(xiǎn)性小,從而在體外基因的轉(zhuǎn)移中具有很大的優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)使用改造后的缺陷性AV-pAd/CMV/V5- DEST (刪除了E1和E3基因)，含有巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子，可使目的基因快速、高水平表達(dá)，便于復(fù)制目的基因及篩選，但是需要在能表達(dá)E1基因的293A細(xì)胞中包裝、產(chǎn)生、擴(kuò)增，轉(zhuǎn)染后在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)卻不表達(dá)E1a、E1b蛋白且腺病毒基因不整合入宿主的基因組。因此，用pAd/CMV/V5-DEST作為目的基因載體比較安全。利用人腺病毒構(gòu)建的載體可用于人類疾病的基因治療，原因在于：①腺病毒的36kb雙鏈DNA基因組易于以等級(jí)基因技術(shù)操作②感染宿主范圍廣③在許可細(xì)胞中病毒能有效復(fù)制⑤在非許可細(xì)胞中，病毒基因組以附加子形式存在，并持續(xù)表達(dá)一段時(shí)間。這些特點(diǎn)使得其成為應(yīng)用于基因治療有很大吸引力的候選載體。本研究以大鼠頸總動(dòng)脈為靶組織，采用不同條件向動(dòng)脈壁導(dǎo)入重組腺病毒，觀察病毒劑量和感染時(shí)間對(duì)感染效率和血管完整性的影響并提供了一個(gè)優(yōu)化的感染方案。 Krüppel樣因子（Krüppel-like factors，KLFs）是一類含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子家族，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖和凋亡等過程。KLF家族中的KLF4高表達(dá)于上皮組織中，尤其是終末分化或有絲分裂后的腸上皮細(xì)胞，提示它與生長(zhǎng)抑制相關(guān)。已有研究表明KLF4是一種生長(zhǎng)抑制相關(guān)基因且它本身是一種細(xì)胞增殖抑制因子。為此利用上述優(yōu)化方案，我們?cè)跇?gòu)建了大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮球囊剝脫模型的基礎(chǔ)上，將KLF4重組腺病毒導(dǎo)入損傷后的頸總動(dòng)脈，觀察外源性KLF4對(duì)血管內(nèi)膜增生的防治效果。研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入外源性KLF4組內(nèi)膜增生程度較感染空病毒組明顯減輕，表明外源性KLF4具有抑制損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生的作用。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究KLF4在血管再狹窄中的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)
