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基本信息

項(xiàng)目名稱(chēng)：
龜板活性成分調(diào)控Shh/Wnt3a信號(hào)通路誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化
小類(lèi)：
生命科學(xué)
簡(jiǎn)介：
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有向成骨分化的潛能，在骨缺損修復(fù)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。以中醫(yī)學(xué)“腎主發(fā)育，主骨生髓”為理論依據(jù)，前期的研究表明，益腎中藥龜板通過(guò)調(diào)控視黃酸受體α（RARα）與維生素D受體（VDR）兩條信號(hào)通路而影響MSCs的增值和分化。本研究立足前期建立的龜板甾類(lèi)成分的分離分析、質(zhì)控及MSCs的成骨分化技術(shù)，免疫組化、Western blot、原位雜交、RT-PCR等方法檢測(cè)成骨分化標(biāo)志物ALP、OPN及VDR的表達(dá)，證實(shí)維生素D受體是龜板提取物誘導(dǎo)MSCs成骨分化的可能藥理靶點(diǎn)；進(jìn)一步結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)，用分子對(duì)接的方法模擬龜板提取物中三個(gè)甾類(lèi)成分（4-甾酮、十四酸甾醇酯、甾醇）與核受體VDR的相互親和力，同時(shí)采用活性導(dǎo)向的標(biāo)準(zhǔn)組分模式來(lái)驗(yàn)證龜板中何種甾類(lèi)成分是誘導(dǎo)MSCs成骨分化的物質(zhì)基礎(chǔ)，并用Shh信號(hào)通路的特異性抑制劑環(huán)杷(Cyclopamine)阻斷Shh信號(hào)通路，探討了引發(fā)這一生物學(xué)效應(yīng)的信號(hào)通路機(jī)制。計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果表明，4-甾酮對(duì)核受體VDR的親和力較十四酸甾醇酯大，而后者又比甾醇大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，龜板活性成分4-甾酮能顯著增加其鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)目，提高成骨分化標(biāo)志物ALP、OPN的表達(dá)水平，并且以劑量依賴(lài)的方式促進(jìn)Shh 及Wnt3a的表達(dá)，表明4-甾酮是龜板提取物誘導(dǎo)MSCs成骨分化的物質(zhì)基礎(chǔ)，其成骨分化的機(jī)制可能與上調(diào)信號(hào)分子Shh 及Wnt3a的表達(dá)有關(guān)。計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果和實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，具有可重復(fù)性。在此基礎(chǔ)上，用Cyclopamine阻斷Shh信號(hào)通路后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Gli1不表達(dá)，Wnt3a略見(jiàn)表達(dá)，而VDR的表達(dá)組間未見(jiàn)明顯改變，推測(cè)其成骨分化的可能機(jī)制與龜板活性小分子直接進(jìn)入細(xì)胞膜作用核受體VDR，進(jìn)而上調(diào)Shh的表達(dá),激活其下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1及Wnt3a信號(hào)，最終啟動(dòng)成骨分化有關(guān)。
詳細(xì)介紹：
1 研究?jī)?nèi)容 1.1 探討龜板提取物誘導(dǎo)MSCs成骨分化的可能維生素D受體機(jī)制，證明VDR是龜板提取物誘導(dǎo)MSCs成骨分化分子藥理靶點(diǎn)。 1.2 探討龜板提取物中誘導(dǎo)MSCs成骨分化的甾類(lèi)物質(zhì)基礎(chǔ)，分子對(duì)接法分析龜板中三種甾類(lèi)成分與核受體VDR的親和力。 1.3 利用體外MSCs成骨分化模型，采用活性導(dǎo)向的標(biāo)準(zhǔn)組分模式來(lái)探討龜板提取物中何種甾類(lèi)成分能誘導(dǎo)MSCs成骨分化，明確龜板中何種甾類(lèi)成分是發(fā)揮該藥效的活性成分。 1.4 利用已篩選出的甾類(lèi)活性成分，作用體外MSCs成骨分化模型，分析Shh、Wnt3a的表達(dá)情況，揭示這兩個(gè)信號(hào)分子在MSCs成骨分化過(guò)程中可能參與的作用。 1.5 利用體外MSCs成骨分化模型，用Shh信號(hào)通路的特異性阻斷劑cyclopamine阻斷該通路，并檢測(cè)信號(hào)分子Gli1、Wnt3a、VDR的表達(dá)情況，揭示龜板誘導(dǎo)MSCs成骨分化的Shh/Wnt3a信號(hào)通路機(jī)制。 2 擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題 2.1 龜板中何種甾類(lèi)成分具有誘導(dǎo)MSCs成骨分化的活性作用。 2.2 龜板中活性甾類(lèi)成分與Shh/Wnt3a信號(hào)通路之間的關(guān)系 3 該實(shí)驗(yàn)分五個(gè)階段進(jìn)行： 3.1 第一階段：龜板提取物誘導(dǎo)MSCs成骨分化的可能維生素D受體的機(jī)制 3.1.1 龜板的鑒定、提取及質(zhì)控 龜板產(chǎn)地為海南省?？谑校蓮V東省汕頭市藥材采購(gòu)供應(yīng)站提供，并經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院鑒定。將龜板低溫粉碎成粗粉，用遞增極性溶劑石油醚、乙酸乙酯、乙醇和水分分步提取龜板，得到具有促進(jìn)MSCs增殖分化作用的乙酸乙酯部位。該部位由甾類(lèi)，脂肪酸及其酯組成，其中甾類(lèi)成分包括4-甾酮、十四酸甾醇酯和甾醇。用GS-MS和HPLC嚴(yán)格質(zhì)控，該研究已獲得一項(xiàng)中藥發(fā)明專(zhuān)利（專(zhuān)利號(hào)：ZL 200610034579.9）及省成果。本實(shí)驗(yàn)用4-甾酮（S1）、十四酸甾醇酯（S2）、甾醇（S3）三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品（均購(gòu)自TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD. TOKYO , JAPAN.TCI）模擬進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，均不溶于水，二甲基亞砜溶解后配置成不同濃度的溶液備用。 3.1.2 MSCs的分離培養(yǎng) 將大鼠股骨、脛骨骨髓用L-DMEM沖出，充分混勻，轉(zhuǎn)入離心管，300g離心10min，去上清，D-Hanks重懸，離心去上清后，加4ml D-Hanks混勻。Percoll分離液按0.56：0.44混合，取4ml放入10ml離心管內(nèi)，吸骨髓液在離液面2cm處貼管壁緩緩加入。水平離心機(jī)900g離心30min，收集單核細(xì)胞層，用DMEM洗滌兩次。然后計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整密度，按1×106/cm2密度接種，37℃，5%飽和濕度的CO2 孵箱培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%FBS的L-DMEM，3天后更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁細(xì)胞，2-3天換液1次，接近融合的MSCs用含0.25%胰酶室溫消化2-3min，按1×104/cm2傳代，傳至第3代得到1×107/cm2個(gè)細(xì)胞。 3.3.3 MSCs的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 條件培養(yǎng)基（Osteo-induced）和龜板提取物分別作用于第3代MSCs，對(duì)照組（Control）不加任何處理因素。Control組培養(yǎng)液為含10%FBS、50U/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素的L-DMEM；Osteo-induced組在Control組基礎(chǔ)上加入50μg/ml維生素C＋10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉＋10-8mol/L地塞米松；S1、S2、S3組在Control組基礎(chǔ)上分別加入龜板提取物30mg/ml；各組以1×105/cm2細(xì)胞密度接種入預(yù)先放置玻片的24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，按組加入處理因素，復(fù)孔，每3天換液1次。7天后行成骨標(biāo)記物ALP、OPN的免疫組織化學(xué)染色及原位雜交。另以1×105/cm2細(xì)胞密度接種入6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，按組加入處理因素，復(fù)孔，每3天換液1次。7天后提取細(xì)胞蛋白行成骨標(biāo)記物ALP、OPN的Western blot檢測(cè)。 3.3.4原位雜交檢測(cè)VDR 24孔板培養(yǎng)3天后細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛（含DEPC）固定30min,新鮮配置3%過(guò)氧化氫-甲醇溶液避光10min, 3%的枸櫞酸1ml+胃蛋白酶2滴消化10min,預(yù)雜交液38℃于20%的甘油濕盒內(nèi)孵育3h，雜交液38℃孵育過(guò)夜；生物素化羊抗地高辛37℃孵育1h，SABC-POD37℃孵育30min,生物素化過(guò)氧化物酶37℃孵育30min。DAB顯色約10min，時(shí)間可根據(jù)顯色情況掌握。水洗，脫水封片。陰性對(duì)照分別用不含探針的雜交緩沖液取代含探針的雜交液，及用正常羊血清取代羊抗地高辛抗體IgG進(jìn)行孵育。每組2張玻片，2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。每張片隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)的200倍視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比（陽(yáng)性細(xì)胞百分比=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)），并與Control組及Osteo-induced組進(jìn)行比較。 3.3.5 免疫組織化學(xué)染色 24孔板處理7天后終止培養(yǎng)，取出蓋玻片，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定，3%過(guò)氧化氫封閉5-10min，滴加羊血清，室溫封閉30min棄去，分別加入（稀釋度1：400）一抗工作液（ALP、OPN），4℃過(guò)夜，0.01M PH 7.2的PBS洗滌液洗滌，再加二抗，即生物素化羊抗兔IgG（稀釋度1：500）室溫下孵育30 min，DBA顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。陰性對(duì)照用PBS代替一抗，實(shí)驗(yàn)對(duì)照用未誘導(dǎo)的細(xì)胞爬片進(jìn)行染色。光鏡下觀察、拍照，判定各組ALP、OPN染色的陽(yáng)性結(jié)果（陽(yáng)性細(xì)胞被染成棕黃色）。每組2張玻片，2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。每張片隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)的200倍視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比（陽(yáng)性細(xì)胞百分比=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)），并與Control組及Osteo-induced組進(jìn)行比較。 3.3.6 Western blot 法檢測(cè) 6孔板處理7天后終止培養(yǎng)，稱(chēng)重，按其重量加入適量蛋白裂解液（RIPA）及蛋白酶抑制劑（PMSF），高速低溫離心（12000×10min），提取細(xì)胞蛋白。取蛋白樣品20μl，加20μl（2×buffer）上樣緩沖液，100℃煮3min，離心5min，各取20μl上樣，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠5%，分離膠10%，于80-100V進(jìn)行電泳80min。完整將分離膠取下，于轉(zhuǎn)移緩沖液靜置30min后，轉(zhuǎn)移夾靠PVDF膜，排除氣泡，以31mA轉(zhuǎn)移60min。取出PVDF膜，TTBS洗5min3次，5%脫脂牛奶封閉30 min，加兔抗大鼠的多克隆抗體ALP、OPN（1：500稀釋?zhuān)匆豢梗?℃過(guò)液，次日用TTBS洗PVDF膜3次，然后加1：5000二抗（羊抗兔IgG-HRP），室溫反應(yīng)1h。用TTBS洗10min 3次，加超敏發(fā)光液反應(yīng)5min，排去液體，用保鮮膜包裹，用X光片在增感屏中緊密接觸，使X光片感光10min，顯影，定影，沖洗，晾干，用Uniscan A686掃描系統(tǒng)將條帶掃描入電腦。每組2張片，2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。 3.3.7 RT-PCR檢測(cè)VDR 提取空白組、成骨誘導(dǎo)組、龜板組三組的基因組，總RNA按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；RT-PCR參照Genbank的cDNA序列，采用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由上海英駿公司合成。VDR上游引物：5-GGAACGTGCCCCGAATCTGC-3，下游引物：3-CACCCCCATCTCCACGAACTG-5，反應(yīng)條件為：93℃ 2 min，然后93℃ 45seconds，63℃ 30secends，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。VDR和GAPDH反應(yīng)條件相同。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以圖像分析儀進(jìn)行吸光度掃描。 3.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以（X±S）表示。應(yīng)用SPSS13.0醫(yī)用統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 3.2 第二階段：分子對(duì)接模擬龜板中三個(gè)甾類(lèi)成分與靶標(biāo)蛋白的關(guān)系 采用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)，用分子對(duì)接的方法模擬了龜板提取物中三個(gè)甾類(lèi)成分（4-甾酮、十四酸甾醇酯、甾醇）與VDR、Shh及Wnt3a等靶標(biāo)蛋白之間的相互作用。（見(jiàn)分子對(duì)接虛擬篩選流程圖） 3.3 第三階段：龜板中誘導(dǎo)MSCs成骨分化甾類(lèi)活性成分的篩選 3.3.1 龜板的鑒定、提取及質(zhì)控 具體方法同上 3.3.2 MSCs的分離培養(yǎng) 具體方法同上 3.3.3 MSCs的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 條件培養(yǎng)基（Osteo-induced）和龜板甾類(lèi)成分4-甾酮（S1）、十四酸甾醇酯（S2）、甾醇（S3）分別作用于第3代MSCs，對(duì)照組（Control）不加任何處理因素。Control組培養(yǎng)液為含10%FBS、50U/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素的L-DMEM；Osteo-induced組在Control組基礎(chǔ)上加入50μg/ml維生素C＋10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉＋10-8mol/L地塞米松；S1、S2、S3組在Control組基礎(chǔ)上分別加入S1、S2、S3各15μg/ml；各組以1×105/cm2細(xì)胞密度接種入預(yù)先放置玻片的24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，按組加入處理因素，復(fù)孔，每3天換液1次。7天后行成骨標(biāo)記物ALP、OPN的免疫組織化學(xué)染色。另以1×105/cm2細(xì)胞密度接種入6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，按組加入處理因素，復(fù)孔，每3天換液1次。7天后提取細(xì)胞蛋白行成骨標(biāo)記物ALP、OPN的Western blot檢測(cè) 3.3.4 鈣化結(jié)節(jié)Von Kossa染色 誘導(dǎo)7天后進(jìn)行鈣化結(jié)節(jié)Von Kossa染色，確定細(xì)胞外基質(zhì)的礦物化。用無(wú)Ca2+、Mg2+雙蒸水洗細(xì)胞3次，多聚甲醛室溫固定4h后，用新鮮配置的5％硝酸銀水溶液浸泡并在紫外線下照射1h；雙蒸水洗滌后，用5％硫代硫酸鈉水溶液反應(yīng)2～3min，以除去多余的銀，蒸餾水再次洗滌。0.2％核固紅水溶液中和染色2min，蒸餾水洗滌，常規(guī)脫水、透明、封片，倒置顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)。 3.3.5 鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色 誘導(dǎo)7天后進(jìn)行鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色，確定細(xì)胞外基質(zhì)的礦物化。培養(yǎng)皿用無(wú)Ca2+、Mg2+PBS沖洗2次，95%乙醇固定10min，無(wú)Ca2+、Mg2+雙蒸水沖洗3次;0.1%茜素紅-Tris-Hcl（PH 8.3）37℃，30min; 蒸餾水洗滌，常規(guī)脫水、透明、封片，倒置顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)。 3.3.6 免疫組織化學(xué)染色 24孔板處理7天后終止培養(yǎng)，取出蓋玻片，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定，3%過(guò)氧化氫封閉5-10min，滴加羊血清，室溫封閉30min棄去，分別加入（稀釋度1：400）一抗工作液（ALP、OPN），4℃過(guò)夜，0.01M PH 7.2的PBS洗滌液洗滌，再加二抗，即生物素化羊抗兔IgG（稀釋度1：500）室溫下孵育30 min，DBA顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。陰性對(duì)照用PBS代替一抗，實(shí)驗(yàn)對(duì)照用未誘導(dǎo)的細(xì)胞爬片進(jìn)行染色。光鏡下觀察、拍照，判定各組ALP、OPN染色的陽(yáng)性結(jié)果（陽(yáng)性細(xì)胞被染成棕黃色）。每組2張玻片，2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。每張片隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)的200倍視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比（陽(yáng)性細(xì)胞百分比=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)），并與Control組及Osteo-induced組進(jìn)行比較。 3.3.7 Western blot 法檢測(cè) 6 孔板處理7天后終止培養(yǎng)，稱(chēng)重，按其重量加入適量蛋白裂解液（RIPA）及蛋白酶抑制劑（PMSF），高速低溫離心（12000×10min），提取細(xì)胞蛋白。取蛋白樣品20μl，加20μl（2×buffer）上樣緩沖液，100℃煮3min，離心5min，各取20μl上樣，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠5%，分離膠10%，于80-100V進(jìn)行電泳80min。完整將分離膠取下，于轉(zhuǎn)移緩沖液靜置30min后，轉(zhuǎn)移夾靠PVDF膜，排除氣泡，以31mA轉(zhuǎn)移60min。取出PVDF膜，TTBS洗5min3次，5%脫脂牛奶封閉30 min，加兔抗大鼠的多克隆抗體ALP、OPN（1：500稀釋?zhuān)匆豢梗?℃過(guò)液，次日用TTBS洗PVDF膜3次，然后加1：5000二抗（羊抗兔IgG-HRP），室溫反應(yīng)1h。用TTBS洗10min 3次，加超敏發(fā)光液反應(yīng)5min，排去液體，用保鮮膜包裹，用X光片在增感屏中緊密接觸，使X光片感光10min，顯影，定影，沖洗，晾干，用Uniscan A686掃描系統(tǒng)將條帶掃描入電腦。用Quantity One 軟件對(duì)圖像進(jìn)行半定量分析，以目的條帶與內(nèi)參β-actin條帶的光密度比值來(lái)表示蛋白含量的相對(duì)值。每組2張片，2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。 3.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以（X±S）表示。應(yīng)用SPSS13.0醫(yī)用統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.3.9 確定甾類(lèi)活性成分 用陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法定量?jī)煞N染色方法所得的鈣化結(jié)節(jié)數(shù)及ALP、OPN免疫組化的結(jié)果，用Quantity One 軟件對(duì)ALP、OPN Western Blot的條帶進(jìn)行半定量分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確定龜板中能誘導(dǎo)MSCs成骨分化的甾類(lèi)活性成分。 3.4 第四階段：Shh及Wnt3a信號(hào)分子在龜板甾類(lèi)活性成分誘導(dǎo)MSCs成骨分化中的作用 3.4.1龜板的鑒定、提取及質(zhì)控 具體方法同上 3.4.2 MSCs的分離培養(yǎng) 具體方法同上 3.4.3 MSCs的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 在設(shè)立對(duì)照組（Control）的前提下，將甾類(lèi)活性成分以不同劑量（3μg/ml、30μg/ml）分別作用于第3代MSCs，Control組培養(yǎng)液為含10%FBS、50U/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素的L-DMEM；Osteo- induced組在Control組基礎(chǔ)上加入50μg/ml維生素C＋10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉＋10-8mol/L地塞米松；其他組在Control組基礎(chǔ)上分別加入不同劑量（3μg/ml、30μg/ml）的甾類(lèi)活性成分。各組以1×105/cm2細(xì)胞密度接種入預(yù)先放置玻片的24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，按組加入處理因素，復(fù)孔，每3天換液1次。7天后行Shh、Wnt3a的免疫組織化學(xué)染色及Western blot檢測(cè)。 3.4.4 免疫組織化學(xué)染色 一抗為兔抗多克隆抗體Shh、Wnt3a，具體方法同上。 3.4.5 Western blot 法檢測(cè) 一抗為兔抗多克隆抗體Shh（1：500稀釋?zhuān)┗騑nt3a（1：1000稀釋?zhuān)?，具體方法同上。 3.4.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 具體方法同上 3.5 第五階段：Shh/Wnt3a信號(hào)通路在龜板活性成分誘導(dǎo)MSCs成骨分化中的作用 3.4.1龜板的鑒定、提取及質(zhì)控 具體方法同上 3.4.2 MSCs的分離培養(yǎng) 具體方法同上 3.4.3 MSCs的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 分為4組，在設(shè)立對(duì)照組（Control）的前提下，將甾類(lèi)活性成分以3μg/ml作用于第3代MSCs，Control組培養(yǎng)液為含10%FBS、50U/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素的L-DMEM；另外兩組分別為：在Control組基礎(chǔ)上加入3μg/ml的甾類(lèi)活性成分及500nmol/L的cyclopamine；單獨(dú)500nmol/L的cyclopamine。各組以1×105/cm2細(xì)胞密度接種入預(yù)先放置玻片的24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，按組加入處理因素，復(fù)孔，每3天換液1次。7天后行Shh、Wnt3a、VDR、Gli1的免疫組織化學(xué)染色及Western blot檢測(cè)。 3.4.4 免疫組織化學(xué)染色 一抗為兔抗多克隆抗體Shh、Wnt3a、VDR、Gli1，具體方法同上。 3.4.5 Western blot 法檢測(cè) 一抗為兔抗多克隆抗體Shh、VDR、Gli1（1：500稀釋?zhuān)┗騑nt3a（1：1000稀釋?zhuān)?，具體方法同上。 3.4.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 具體方法同上

作品專(zhuān)業(yè)信息

撰寫(xiě)目的和基本思路

以“腎主發(fā)育，主骨生髓”的為理論依據(jù)，本研究運(yùn)用組織化學(xué)、免疫組化、Western blot、原位雜交、RT-PCR等技術(shù)，探討龜板提取物誘導(dǎo)MSCs成骨分化的VDR機(jī)制；進(jìn)一步用分子對(duì)接模擬龜板提取物中三個(gè)甾類(lèi)成分（4-甾酮、十四酸甾醇酯、甾醇）對(duì)核受體VDR的親和力，并從實(shí)驗(yàn)科學(xué)的角度闡明龜板中何種甾類(lèi)成分是誘導(dǎo)MSCs成骨分化的物質(zhì)基礎(chǔ)，并分析其成骨分化的Shh/Wnt3a信號(hào)通路機(jī)制。

科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處

1、以“腎主發(fā)育，主骨生髓”為依據(jù)，立足前期對(duì)龜板及信號(hào)通路的研究，選題起點(diǎn)高，具有科學(xué)性及獨(dú)特之處。 2、循交叉學(xué)科，將分子對(duì)接引入到中醫(yī)藥研究中，計(jì)算機(jī)模擬與實(shí)驗(yàn)科學(xué)相結(jié)合，使研究結(jié)果真實(shí)可靠，具有先進(jìn)性。 3、采用活性導(dǎo)向的標(biāo)準(zhǔn)組分模式，揭示了龜板誘導(dǎo)MSCs成骨分化的Shh/Wnt3a信號(hào)通路機(jī)制。 4、證實(shí)4-甾酮是MSCs成骨分化活性物質(zhì)基礎(chǔ)，為創(chuàng)新中藥的研究設(shè)計(jì)提供一條新思路。

應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義

1、從干細(xì)胞信號(hào)分子的角度闡明“腎主發(fā)育，主骨生髓”的機(jī)理，提出維生素D受體、Shh信號(hào)通路有望成為相關(guān)骨疾病的治療靶點(diǎn)。 2、將計(jì)算機(jī)模擬與實(shí)驗(yàn)科學(xué)有機(jī)結(jié)合，發(fā)現(xiàn)一個(gè)具有成骨生物活性的甾體，為創(chuàng)新中藥的研究提供新的思路。具有開(kāi)拓性，可為同行研究提供參考。 3、揭示龜板誘導(dǎo)成骨分化的活性物質(zhì)基礎(chǔ)，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有的突出中醫(yī)藥理論特色。

學(xué)術(shù)論文摘要

以中醫(yī)學(xué)“腎主發(fā)育，主骨生髓”為理論依據(jù)，本研究采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)等方法檢測(cè)ALP、OPN及VDR的表達(dá)，證實(shí)維生素D受體是龜板提取物誘導(dǎo)MSCs成骨分化的可能藥理靶點(diǎn)；用分子對(duì)接的方法模擬龜板中三個(gè)甾類(lèi)成分與VDR的親和力，結(jié)果表明，4-甾酮對(duì)核受體VDR的親和力較后兩者大；采用活性導(dǎo)向的標(biāo)準(zhǔn)組分模式來(lái)驗(yàn)證龜板中何種甾類(lèi)成分是誘導(dǎo)MSCs成骨分化的物質(zhì)基礎(chǔ)，并探討其信號(hào)通路機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，龜板活性成分4-甾酮能顯著增加其鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)目，提高ALP、OPN、OCN的表達(dá)水平，并且以劑量依賴(lài)的方式促進(jìn)Shh 及Wnt3a的表達(dá)，表明4-甾酮是龜板提取物誘導(dǎo)MSCs成骨分化的物質(zhì)基礎(chǔ)，其成骨分化的機(jī)制可能與上調(diào)信號(hào)分子Shh 及Wnt3a的表達(dá)有關(guān)。Cyclopamine阻斷Shh信號(hào)通路后，Gli1及Wnt3a的表達(dá)明顯下降，而VDR的表達(dá)組間未見(jiàn)明顯改變，推測(cè)其成骨分化的可能機(jī)制與龜板活性小分子直接進(jìn)入細(xì)胞膜作用核受體VDR，進(jìn)而上調(diào)Shh的表達(dá),激活其下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1及Wnt3a，最終啟動(dòng)成骨分化有關(guān)。

獲獎(jiǎng)情況

1、龜板提取物誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化和維生素D受體的表達(dá)——中草藥（已投稿） 2、龜板活性成分4-甾酮上調(diào)Shh及Wnt3a信號(hào)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化——中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志（已投稿）

鑒定結(jié)果

無(wú)

參考文獻(xiàn)

現(xiàn)有技術(shù)：1、本研究龜板有效成分的提取、質(zhì)量控制科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)，其促增值活性已獲得一項(xiàng)中藥發(fā)明專(zhuān)利（專(zhuān)利號(hào)：ZL 2006- 10034579.9）、一項(xiàng)學(xué)?？萍汲晒氐泉?jiǎng)，一項(xiàng)廣東省科技成果三等獎(jiǎng)。2、徐筱杰教授小組開(kāi)發(fā)的中藥有效成分三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)、中國(guó)科學(xué)院上海藥物所開(kāi)發(fā)的中國(guó)天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)以及中國(guó)科學(xué)院工程過(guò)程研究所開(kāi)發(fā)的中藥化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)。 技術(shù)文獻(xiàn)： [1] D.-F. Chen, H.-P. Zeng, S.-H. Du,et al.Extracts from Plastrum Testudinis promotes proliferation of rat bone-marrow derived mesenchymal stem cells[J].Cell Proliferation, 2007, 40, 196-212, SCI，IF=4.5. [2] 陳薇，曾和平，王春燕，等.中藥龜板提取物化學(xué)成分及其調(diào)控鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rMSCs)增殖活性的實(shí)驗(yàn)研究[J].化學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 65(3):265-270. SCI，IF=0.85. [3] He-Ping Zeng, Ting-Ting Wang, Xin-Hua Ouyang, et al. 8-Hydroxyquinoline derivatives induce theproliferationof rat mesenchymal stem cells (rMSCs)[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2006, 14: 5446-5450. SCI，IF=2.2. [4] D. F. CHEN, J. H. ZHOU, H. LI,et al. Effects of traditional Chinese drug on proliferation of rat mesenchymal stem cell in vitro[J]. The FEBS Journal.2005; 272(suppl.1): 141.SCI，IF=3.2. [5] 朱偉， 陳可冀，徐筱杰.計(jì)算機(jī)藥物虛擬篩選技術(shù)在中醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用前景.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，27（3）：263-266.

同類(lèi)課題研究水平概述

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向成骨分化 MSCs的數(shù)量和功能是維持正常骨穩(wěn)態(tài)的決定性因素。因此，維持MSCs的成骨分化潛能具有現(xiàn)實(shí)的意義。目前誘導(dǎo)MSCs成骨分化大致有兩種：一是不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)MSCs成骨分化，但細(xì)胞因子（如BMP、TGF-β、bFGF）的獲得，方法繁瑣、收獲量少、純度低，在體內(nèi)極易被降解破壞，難以滿(mǎn)足研究和臨床應(yīng)用。二是中藥活性成分誘導(dǎo)MSCs成骨分化。中藥的活性成分是中藥治療與預(yù)防疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)，國(guó)內(nèi)學(xué)者提取中藥有效成分（大黃素、淫羊藿總黃酮、金雀異黃酮）觀察它們對(duì)于MSCs成骨分化的影響。總體來(lái)看，他們的研究為中藥的現(xiàn)代化指明了方向，不可否認(rèn)的是，他們并沒(méi)有更為深入地探討中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)及靶信號(hào)、靶蛋白。 2、VDR、Shh及Wnt3a與骨代謝 Shh蛋白能夠直接影響多潛能的前體細(xì)胞（如：C3H10T1/2、C2C12、2T3細(xì)胞）向成骨細(xì)胞分化，或者直接作用BMPs家族成員，再作用干細(xì)胞，最終提高成骨分化早期標(biāo)志物ALP的活性表達(dá)。Wnts蛋白是調(diào)控間充質(zhì)細(xì)胞特性的關(guān)鍵因素，通過(guò)控制成骨細(xì)胞分化、增殖、凋亡從而多層次調(diào)控成骨細(xì)胞生理及出生后骨量的獲得。Wnt3a作為Wnts家族的成員，亦是調(diào)控間充質(zhì)細(xì)胞特性的關(guān)鍵因素，可影響多潛能的前體細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過(guò)程。有文獻(xiàn)指出，Wnt3a是Shh的下游，Shh誘導(dǎo)的成骨分化至少有部分是通過(guò)Wnt3a介導(dǎo)的。VDR是介導(dǎo)1，25 (OH)-D3發(fā)揮生物效應(yīng)的核內(nèi)生物大分子，它在維持機(jī)體鈣、磷代謝，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化等方面起重要作用。通過(guò)研究VDR基因敲除小鼠發(fā)現(xiàn)，VitD的大多數(shù)生物學(xué)作用是通過(guò)VDR介導(dǎo)的，VDR缺陷可引起多種疾病的發(fā)生。 3、計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用 分子對(duì)接法是一種基于受體大分子三維結(jié)構(gòu)來(lái)尋找先導(dǎo)化合物的重要方法。對(duì)接計(jì)算時(shí)，將配體分子放到受體活性位點(diǎn)，然后按照幾何互補(bǔ)、能量互補(bǔ)以及化學(xué)環(huán)境互補(bǔ)的原則來(lái)實(shí)時(shí)評(píng)價(jià)配體與受體相互作用的好壞。國(guó)內(nèi)外運(yùn)用該系統(tǒng)進(jìn)行輔助藥物設(shè)計(jì)，取得了一定的成果。徐筱杰等將計(jì)算機(jī)藥物虛擬篩選技術(shù)應(yīng)用于中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究，初步建立了中草藥有效成分三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)和北京大學(xué)藥物設(shè)計(jì)系統(tǒng)的兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)。陳凱先等、Judith等以受體為靶點(diǎn)，進(jìn)行了較為大規(guī)模的藥物篩選，取得了已經(jīng)的影響。但普及程度不高、交叉應(yīng)用較少。
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