基本信息
- 項目名稱：
- 馬氏珠母貝抗菌肽的分離純化及其活性分析
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 馬氏珠母貝是用于海水珍珠生產(chǎn)的主要種類，具有重要的經(jīng)濟價值。然而，在當前馬氏珠母貝養(yǎng)殖中，病害日益嚴重和養(yǎng)殖珍珠質(zhì)量持續(xù)下降等問題使海水珍珠產(chǎn)業(yè)的發(fā)展面臨著巨大困難，為了避免由于過量及反復(fù)使用抗生素和化學(xué)藥物導(dǎo)致的耐藥性、藥物殘留和污染環(huán)境等問題，對尋求控制馬氏珠母貝病害和提高珍珠養(yǎng)殖質(zhì)量的合適方法，本研究從分析馬氏珠母貝非特異性免疫因子——抗菌肽著手，采用冰醋酸抽提技術(shù)、DEAE Sephadex A-50 和 Sephadex G-75離子層析技術(shù)、聚丙烯酰胺凝膠電泳等，分離純化出具有廣譜高效的天然抗菌肽，并對其抗菌活性、抗菌譜和分子結(jié)構(gòu)進行了初步研究和鑒定。本研究不僅為開發(fā)利用馬氏珠母貝抗菌肽、克隆cDNA以及分子表達提供一定前期基礎(chǔ)，同時也為研究和開發(fā)水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害防治新藥提供了一個嶄新的視野和模式。
- 詳細介紹：
- 抗菌肽（antimicrobial peptides）是生物體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一類對抗外源性病原體致病作用的肽類活性物質(zhì)，是生物體重要的非特異性免疫因子，不僅具有廣譜的抗菌活性，還有明顯的抗病毒、抗絲狀真菌和抗原生動物類寄生蟲等作用，有些還能在不影響動物體正常細胞的情況下選擇性殺傷腫瘤細胞以及抑制乙肝病毒的復(fù)制等。由于抗菌肽具有作用迅速、抗病原能力強、抗病原譜廣、活性穩(wěn)定、不易產(chǎn)生耐藥性以及耐高溫和耐高鹽等特點，其作用機制具有抗生素?zé)o法比擬的優(yōu)越性，被認為是最有可能替代現(xiàn)有抗生素用于疾病防治的新型抗菌藥物，目前已成為免疫學(xué)、分子生物學(xué)、藥學(xué)和食品科學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點。 由于水生無脊椎動物缺乏特異性免疫功能，它們對外來病原的防御只能完全依靠非特異性免疫系統(tǒng)，在這種情況下，其體內(nèi)的各種非特異性免疫因子對其保持健康的作用要比脊椎動物更為重要。已有研究表明，抗菌肽作為重要的非特異性免疫因子，其在水生生物特別是水生無脊椎動物中的數(shù)量和種類比陸生動物更加豐富，活性也更強。在海南，馬氏珠母貝已被確定為優(yōu)先發(fā)展的五大支柱性水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，然而對其抗菌肽的類型、活性以及抑菌作用尚未見系統(tǒng)的研究報道。本文采用冰醋酸提取法分離獲得了抗菌肽，并對所分離的抗菌肽的理化性質(zhì)和抑菌活性進行了分析。 1. 馬氏珠母貝抗菌肽的分離純化 將馬氏珠母貝的鰓，勻漿后取上清液。利用DEAE Sephadex A-50 和 Sephadex G-75，對勻漿物進行分離純化。 經(jīng) DEAE Sephadex A-50陰離子交換層析，共得到五個組分峰，經(jīng)抗菌活性粗篩，洗脫峰第Ⅴ峰(收集管74-81)抗菌活性較強。將該組分峰收集后進一步用Sephadex G-75凝膠過濾層析分離，共得到兩個組分峰，其中第Ⅱ峰(收集管100~102)抗菌活性較強。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳圖譜顯示為單一的蛋白質(zhì)條帶，分子量約30 000 Da，將其命名為PM-AMP。 2. 馬氏珠母貝抗菌成分的抗菌活性研究 用紙片瓊脂擴散法測定了馬氏珠母貝鰓粗提取物的抗菌活性。測試菌株包括革蘭氏陰性菌，大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)和革蘭氏陽性菌，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)。實驗結(jié)果顯示，當樣品濃度為OD280＝1.3時，對革蘭氏陰性菌除副溶血弧菌的抑菌圈直徑達9mm外，對其它各菌抑菌圈直徑達均11mm以上。對革蘭氏陽性菌，金黃葡萄球菌的抑菌圈直徑達10mm，但對枯草芽胞桿菌無抑制作用。利用微量稀釋法測定純化的PM-AMP對以上各菌的抑菌活性。實驗結(jié)果表明，PM-AMP具有廣譜抗菌活性，對革蘭氏陰性菌和陽性菌均有明顯的抗菌作用，但對枯草芽胞桿菌無抑制。 用微量稀釋法分別測定了純化的抗菌肽最低抑菌濃度MIC（μmol/L），抗菌肽對4種標準菌株大腸埃希氏菌、綠膿桿菌、嗜水汽單胞菌、金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌的MIC（μg/mL）分別為100μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL和750μg/mL?？梢奝M-AMP對不同細菌的抑菌率和最低抑菌濃度（MIC）明顯不同，對革蘭氏陰性菌的抗菌效果明顯較革蘭氏陽性菌強。溶血實驗結(jié)果顯示，PM-AMP具有較弱的溶解魚紅細胞的作用，具有一定的應(yīng)用前景。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 在水產(chǎn)動物疾病防治上，隨著抗生素等化學(xué)藥物反復(fù)使用次數(shù)的增多和用量的加大，產(chǎn)生的毒副作用如藥物殘留、耐藥性和污染環(huán)境等問題阻礙了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。本作品就是為了尋求控制馬氏珠母貝病害和提高珍珠養(yǎng)殖質(zhì)量的合適方法，從生物自身免疫能力入手，對生物體本身具有的非特異性免疫因子——抗菌肽進行分離純化，以期找到抗生素的替代品用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害的防治，提供一個開發(fā)和研究新藥的嶄新視野和模式。
科學(xué)性、先進性及獨特之處
- 抗菌肽具有作用迅速、抗病原能力強、抗病原譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性等特點，被認為是替代現(xiàn)有抗生素用于疾病防治的新型抗菌藥物。水生無脊椎動物由于缺乏特異性免疫功能，其體內(nèi)的各種非特異性免疫因子，尤其是抗菌肽對其保持健康比陸生動物更為重要。已有研究表明，抗菌肽在水生無脊椎動物中的數(shù)量和種類比陸生動物更加豐富，活性也更強，但對海洋無脊椎動物抗菌肽的研究報道并不多，對馬氏珠母貝抗菌肽的研究更未見報道。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 本項目研究不僅揭示了馬氏珠母貝的部分免疫機制，為控制其病害和提高養(yǎng)殖珍珠質(zhì)量探索合適方法奠定了基礎(chǔ)，并且從馬氏珠母貝中發(fā)現(xiàn)和分離到了一種具有廣譜抗菌活性，對多種已產(chǎn)生耐藥性的水產(chǎn)動物病原菌以及人類致病菌具有殺滅或抑制作用的抗菌肽。該結(jié)果將可促進具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的新藥（包括替代抗生素的新型水產(chǎn)藥物和人用藥物、抗腫瘤藥物、水產(chǎn)飼料添加劑等）研究和開發(fā)，具有重要的理論和實際意義。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 馬氏珠母貝是海南省優(yōu)先發(fā)展的支柱水產(chǎn)品種之一，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展起著重要的作用。近年來，由于馬氏珠母貝病害日益嚴重，使得該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展面臨著巨大困難。為了尋求控制馬氏珠母貝病害和提高珍珠貝養(yǎng)殖質(zhì)量的合適方法，本研究從分析馬氏珠母貝非特異性免疫因子——抗菌肽著手，利用冰醋酸抽提技術(shù)、DEAE Sephadex離子層析技術(shù)、聚丙烯酰胺凝膠電泳等，分離純化出具有廣譜高效的天然抗菌肽，并對其抗菌活性、抗菌譜和分子結(jié)構(gòu)進行了初步研究和鑒定。本研究不僅為開發(fā)利用馬氏珠母貝抗菌肽、克隆cDNA以及分子表達提供一定前期基礎(chǔ)，同時也為研究和開發(fā)水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害防治新藥提供了一個嶄新的視野和模式。
獲獎情況
- 2009年5月獲得某校“挑戰(zhàn)杯”大學(xué)生課外科技作品競賽一等獎。
鑒定結(jié)果
參考文獻
- ［1］Iijima R, Kisugi J, Yamazaki M. A novel antimicrobial peptide from the sea hare Dolabella uricularia[J]. Developmental & Comparative Immunology, 2003, 27:305-311. ［2］Matsuzald K., Murase O., Fujii N., et al.. An antimicrobial peptide, magainin 2, induced rapid flip-flop of phospholipids coupled with pore formation and peptide translocation[J]. Biochemistry, 2003,35:11361-11368. ［3］Reddy P S & Reddy P R. Purification of molt-inhibiting hormone-like peptides with hyperglycemic activity from the eyestalks of the crab Scylla serrata[J]. Fisheries Science, 2006, 72: 415-420. ［4］Seo J K, Crawford J M, Stone K L, et al. Purification of a novel arthropod defensin from the American oyster Crassostrea virginica[J]. Biochemical and Biophysical Research Communication, 2005, 338:1988-2004. ［5］Silphaduang U, Noga E J. Peptide antibiotics in mast cells of fish[J]. Nature, 2001, 414:268-269
同類課題研究水平概述
- 抗菌肽是生物體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一類對抗外源性病原體致病作用的肽類活性物質(zhì)，具有作用迅速、抗病原能力強、抗病原譜廣、活性穩(wěn)定、不易產(chǎn)生耐藥性以及耐高溫和耐高鹽等特點，其作用機制具有抗生素?zé)o法比擬的優(yōu)越性，被認為是最有可能替代現(xiàn)有抗生素用于疾病防治的新型抗菌藥物。自1972年瑞典科學(xué)家Steiner等人分離獲得cecropin以來，多種抗菌肽相繼被分離純化。迄今為止，已從哺乳動物、植物、昆蟲、兩棲、水生動物甚至微生物中分離純化出800多種。不過，目前所分離獲得的抗菌肽主要來自于陸生生物，水生動物中分離的抗菌肽不到200種，從海洋生物中分離出的抗菌肽則更少，這可能是由于海洋生物抗菌肽的分離純化工作起步較晚造成的。 自1988年Nakamura等從鱟（Tachpleus tridentatus）中分離獲得鱟素（Tachyplesin）后，海洋生物在抗菌肽分離純化方面開始受到重視。由于水是許多病原微生物生長繁殖的適宜場所，因此水生生物比陸生生物更容易受到病原的侵襲；特別對于水生無脊椎動物而言，由于缺乏特異性免疫功能，它們對外來病原的防御只能完全依靠非特異性免疫系統(tǒng)，在這種情況下，其體內(nèi)的各種非特異性免疫因子對其保持健康就更為重要。已有研究表明，抗菌肽作為重要的非特異性免疫因子，其在水生生物特別是水生無脊椎動物中的數(shù)量和種類比陸生動物更加豐富，活性也更強。不過，目前僅對幾種海洋軟體動物抗菌肽進行了研究，如截尾海兔（Dolabella auricularia）、紫貽貝（Mytilus edulis）、地中海貽貝（mediterranean mussel）、巨牡蠣（Crassostrea gigas）和美洲牡蠣（Crassostrea virginica），分離獲得的抗菌肽對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、病毒、真菌以及原生動物寄生蟲等表現(xiàn)出不同的活性。因此，對海洋軟體動物抗菌肽進行廣泛的研究，研究結(jié)果不僅可為控制海洋生物病害和提高養(yǎng)殖品種質(zhì)量探索合適方法，還有助于發(fā)現(xiàn)具有較強活性的新型抗菌肽類，推動具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的新藥（包括替代抗生素的新型水產(chǎn)藥物和人用藥物、抗腫瘤藥物、水產(chǎn)飼料添加劑等）研究和開發(fā)，具有重要的理論和實際意義。
