基本信息
- 項目名稱：
- rhFGF-1ser98,132的定點化學修飾及修飾產(chǎn)物活性和穩(wěn)定性研究
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術(shù)論文
- 簡介：
- 重組人成纖維細胞生長因子-1（rhFGF-1）作為一種重要的功能蛋白，長期的研究和實踐表明，其對各類創(chuàng)傷及潰瘍，尤其是大面積創(chuàng)面具有突出的促愈合作用。同時，臨床實踐還表明，F(xiàn)GF-1對心肌梗死、糖尿病并發(fā)的下肢潰瘍、神經(jīng)退行性疾病等均具有重要的作用。然而，rhFGF-1存在體外穩(wěn)定性差、體內(nèi)半衰期短的缺陷日益構(gòu)成該藥產(chǎn)業(yè)化應用的“技術(shù)瓶頸”。本課題采用化學修飾劑聚乙二醇（PEG）定點修飾突變體rhFGF-1ser98,132，可以增強rhFGF-1的生物穩(wěn)定性，延長體內(nèi)半衰期，降低免疫原性。為開發(fā)穩(wěn)定性更好、安全性更高的rhFGF-1新型制劑奠定基礎。
- 詳細介紹：
- rhFGF-1作為一種重要的功能蛋白，其部分制劑已經(jīng)上市并產(chǎn)生了可觀的經(jīng)濟和社會效益，但該類生長因子新藥作為蛋白藥物，穩(wěn)定性差、體內(nèi)生物半衰期短也一直是臨床使用過程亟待解決的難題。課題組在前期研究工作基礎上提出了以聚乙二醇（PEG）為化學修飾劑對rhFGF-1進行化學修飾，以期獲得穩(wěn)定性和安全性好的新型蛋白藥物的新思路。更為關(guān)鍵的是，課題組認識到，長期以來，蛋白質(zhì)的定點修飾一直是科學研究熱點，這是因為隨機的化學修飾會增加后續(xù)樣品純化的復雜性。通過對hFGF-1的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)其一級結(jié)構(gòu)中共含有三個半胱氨酸（Cys）殘基，分別位于第31，98，132位，第98位和第132位半胱氨酸對于維持蛋白質(zhì)的活性是不必需的，因此本課題組創(chuàng)造性的采用基因工程方法用中性氨基酸如：絲氨酸（Ser）、丙氨酸（Ala）取代Cys，構(gòu)建了活性保存率好的突變體rhFGF-1ser98,132。通過離子交換、肝素親和兩步層析純化，獲得了促Balb/c 3T3細胞增值活性與天然hFGF-1對照品相似的rhFGF-1 ser98,132突變體純品，并用20kDPEG-馬來酸酰亞胺酯對其進行定點化學修飾，修飾產(chǎn)物除保留了生長因子的促分裂活性外，在熱穩(wěn)定性、抗胰蛋白酶水解能力、動物體內(nèi)穩(wěn)定性方面均有明顯的改善。本課題為如何解決hFGF-1長期存在的穩(wěn)定性差、具有免疫原性等臨床缺陷提供了重要的方法；同時為改善和提高生長因子及其他蛋白藥物的生物學性能提供了有效的理論和實驗手段，具有較為重要的理論和現(xiàn)實意義；該項目的成功實施有望在世界上搶先獲得專利并部分地代替現(xiàn)有產(chǎn)品。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 與其他蛋白類藥物一樣，rhFGF-1也存在穩(wěn)定性差、體內(nèi)半衰期短的問題，同時，由于通常在構(gòu)建過程中對其序列進行一定地改造，也使其在一定程度上存在免疫原性問題。用20kDPEG-馬來酸酰亞胺定點修飾rhFGF-1ser98,132，可以增強其生物穩(wěn)定性，延長體內(nèi)半衰期，降低免疫原性。為開發(fā)穩(wěn)定性更好、安全性更高的rhFGF-1新型制劑奠定基礎。
科學性、先進性及獨特之處
- 本課題屬于自主創(chuàng)新類課題。hFGF-1第98位和第132位半胱氨酸對于維持蛋白質(zhì)的活性是不必需的，因此創(chuàng)造性地采用PCR的方法獲得了rhFGF-1突變體rhFGF-1ser98,132 ,并采用20kDPEG-馬來酸酰亞胺成功實現(xiàn)了對rhFGF-1的定點化學修飾。通過上述修飾，獲得的修飾產(chǎn)物不僅活性保存率高而且穩(wěn)定性取得了較大地提高，有效克服了rhFGF-1蛋白穩(wěn)定性差的缺陷。
應用價值和現(xiàn)實意義
- rhFGF-1可廣泛用于治療各類創(chuàng)傷、潰瘍、神經(jīng)損傷、眼科等疾病。但其穩(wěn)定性差、半衰期短的缺陷卻大大限制了其臨床應用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PEG修飾可以有效地提高蛋白的穩(wěn)定性、延長體內(nèi)半衰期。因此本課題擬采用PEG化學修飾擬實現(xiàn)FGF-1的高穩(wěn)定性和延長半衰期無疑具有重要的意義。相信該課題的成功實施，必將為打破制約FGF-1產(chǎn)業(yè)化推廣的關(guān)鍵技術(shù)“瓶頸”、拓展FGF-1的臨床應用起到積極的推動作用。
學術(shù)論文摘要
- 題目：rhFGF-1ser98,132的定點化學修飾及修飾產(chǎn)物活性和穩(wěn)定性研究 目的：用20kDPEG-馬來酸酰亞胺定點修飾rhFGF-1ser98,132，以增強其生物穩(wěn)定性，延長體內(nèi)半衰期，降低免疫原性。 方法：采用PCR法構(gòu)建了用絲氨酸取代rhFGF-1的第98，132位半胱氨酸的突變體rhFGF-1ser98,132，然后用20kDPEG-馬來酸酰亞胺對rhFGF-1突變體的第31位半胱氨酸殘基進行定點化學修飾。 結(jié)果：通過對修飾過程優(yōu)化，蛋白修飾產(chǎn)率能夠達到51.8%。與非修飾型rhFGF-1相比，經(jīng)PEG修飾的rhFGF-1仍保留著約52.5%的有絲分裂原活性和相似的二級結(jié)構(gòu)。此外，其熱穩(wěn)定性和抗酶解穩(wěn)定性顯著提高。 結(jié)論：經(jīng)過PEG定點化學修飾，rhFGF-1的熱穩(wěn)定性和抗酶解穩(wěn)定性顯著提高。 關(guān)鍵詞：聚乙二醇修飾 成纖維細胞生長因子 化學修飾 穩(wěn)定性
獲獎情況
- 1. 英文文章已投稿于《Singapore 2009 International Conference on biotechnology and Nalotechnology 》，目前已收到邀請函； 2．論文《PEG-hFGF-1對SD大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護作用》已投稿于《中國生物工程雜志》； 3．已申請發(fā)明專利一項：《成纖維細胞生長因子-1及其突變體的聚乙二醇修飾產(chǎn)物》，受理號：200910099031.6； 4.浙江省第十一屆“挑戰(zhàn)杯”大學生課外學術(shù)科技作品競賽特等獎。
鑒定結(jié)果
參考文獻
- 1.J Invest Dermatol.104,850-5. 2.Surgery.120,182-188. 3.Biochem Biophys Res Commun.171,1387-94. 4.J Biol Chem.266,5842-6. 5.Proc Natl Acad Sci USA.84,1487-91. 6.J.Biol.Chem.269,7610-6. 7.Growth Factors.3,287-98.
同類課題研究水平概述
- 蛋白質(zhì)化學修飾技術(shù)是近年來快速發(fā)展的新興技術(shù)。蛋白質(zhì)的化學修飾是指通過以某些物質(zhì)如PEG、葡聚糖、肝素等作為化學修飾劑與蛋白質(zhì)的活性基團發(fā)生反應，從而達到改善蛋白質(zhì)性質(zhì)，如解除異體蛋白質(zhì)免疫原性、毒副作用以及增加活性、提高穩(wěn)定性、延長體內(nèi)半衰期的目的。 在蛋白質(zhì)的化學修飾中，修飾劑的選擇非常重要。一般條件下，要求修飾劑具有較大的分子量，良好的生物相容性及水溶性，修飾劑分子表面有較多的反應活性基團等，歸因于PEG類修飾劑的卓越特性，目前應用最為廣泛?；瘜W修飾的另一個關(guān)鍵點即選擇合適的修飾位點，以前對于蛋白質(zhì)或肽類分子，常常參與反應的修飾基團為α-氨基和ε-氨基，但針對該類基團的化學修飾，隨機性和偶然性比較大，對分離制備帶來了很大的困難，目前針對特異位點的定點修飾成為研究熱點，其中主流的方法有：① 通過定點突變的方法，引入游離的半胱氨酸殘基，采用合適的修飾劑對該突變體實現(xiàn)定點修飾；② 通過設計特定的化學修飾制劑與蛋白質(zhì)中特定的糖類殘基或-0H發(fā)生特異性的偶聯(lián)反應，實現(xiàn)定點修飾。 到目前為止，國內(nèi)外PEG修飾技術(shù)已經(jīng)被應用于近100種不同酶類、蛋白、多肽和其它化合物。PEG修飾蛋白質(zhì)藥物己廣泛應用于臨床。但在這方面，國外由于起步較早，已經(jīng)遠遠領(lǐng)先于我國，到目前為止，國外已有超過10種PEG修飾蛋白上市，如：干擾素α-2b、干擾素α-2α、粒細胞集落刺激因子、生長抑制素、水凝膠和天冬酰胺酶等，并且最近五年平均每年都有一個該類新藥上市；我們國家雖然有部分科研院和高校如中國藥科大學、天津大學、中國科學院、上海生化所開展相關(guān)的研究，但相比國外而言，起步晚，而且僅限于實驗室階段，差距非常明顯，這無疑對我們提出了非常嚴峻的考驗。 本課題為實現(xiàn)對成纖維細胞生長因子-1（FGF-1）的定點化學修飾，創(chuàng)造性地采用基因工程方法獲得了FGF-1突變體FGF-1ser98,132并采用PEG-馬來酰亞胺實現(xiàn)了對FGF-1的定點化學修飾，在國內(nèi)外均屬獨創(chuàng)性研究。本研究通過正交試驗獲得了FGF-1的最佳修飾條件，在最佳修飾條件下，修飾產(chǎn)率達到51.8%，顯著高于國內(nèi)有關(guān)其他蛋白如IFN、GSF的化學修飾的報道；同時修飾產(chǎn)物在很好地保留蛋白活性的基礎上，表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性和抵抗胰蛋白酶降解的能力，該研究與國內(nèi)外研究相比具有較強的創(chuàng)新性，并具有廣闊的臨床應用前景。
