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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 花鰻鱺促性腺激素的基因克隆與酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 本研究克隆了花鰻鱺促性腺激素（GTH）的3個(gè)亞基（GTHα、FSHβ、LHβ）基因的cDNA，GTHα cDNA全長(zhǎng)362 bp，其中開放閱讀框長(zhǎng)351 bp，編碼116個(gè)氨基酸，包括24個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、92個(gè)氨基酸的的成熟肽。FSHβ cDNA全長(zhǎng)458 bp，其中開放閱讀框長(zhǎng)384 bp，編碼127個(gè)氨基酸，包括22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、105個(gè)氨基酸的的成熟肽。LHβ cDNA全長(zhǎng)536 bp，其中開放閱讀框長(zhǎng)423 bp，編碼140個(gè)氨基酸，包括24個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、116個(gè)氨基酸的的成熟肽。組織分布研究表明GTHs除了在腦垂體有表達(dá)外，在性腺中也有較高的表達(dá)。Real-time PCR定量分析表明：腦垂體中GTHα和LHβmRNA水平在性腺發(fā)育成熟過程中不斷升高，而FSHβmRNA水平在性腺發(fā)育早期較高，隨著性腺發(fā)育成熟不斷下降，說明FSH在性腺發(fā)育和配子發(fā)生的早期起主要作用，而LH主要是調(diào)控性腺發(fā)育的最后成熟。本研究還成功地構(gòu)建了花鰻鱺GTHs的酵母表達(dá)載體，為今后表達(dá)出有生物活性的花鰻鱺促性腺激素，開展花鰻鱺神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)和人工繁殖研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
- 詳細(xì)介紹：
- 本作品針對(duì)鰻鱺人工繁殖的世界性難題，結(jié)合我國鰻鱺養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，特別是海南近年來花鰻鱺養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展的實(shí)際需要，以我國名貴經(jīng)濟(jì)魚類、二級(jí)保護(hù)動(dòng)物——花鰻鱺為研究對(duì)象，以基因工程技術(shù)為切入口，克隆了GTHs亞基基因的cDNA，并分析了在性腺發(fā)育成熟過程中的表達(dá)特征以及生理功能，構(gòu)建了花鰻鱺GTHs的酵母表達(dá)體系，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行花鰻鱺人工誘導(dǎo)繁殖研究。研究結(jié)果表明：花鰻鱺促性腺激素的GTHα cDNA全長(zhǎng)362 bp，其中開放閱讀框長(zhǎng)351 bp，編碼116個(gè)氨基酸，包括24個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、92個(gè)氨基酸的的成熟肽。FSHβ cDNA全長(zhǎng)458 bp，其中開放閱讀框長(zhǎng)384 bp，編碼127個(gè)氨基酸，包括22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、105個(gè)氨基酸的的成熟肽。LHβ cDNA全長(zhǎng)536 bp，其中開放閱讀框長(zhǎng)423 bp，編碼140個(gè)氨基酸，包括24個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、116個(gè)氨基酸的的成熟肽。組織分布研究表明GTHs除了在腦垂體有表達(dá)外，在性腺中也有較高的表達(dá)。Real-time PCR定量分析表明：腦垂體中GTHα和LHβmRNA水平在性腺發(fā)育成熟過程中不斷升高，而FSHβmRNA水平在性腺發(fā)育早期較高，隨著性腺發(fā)育成熟不斷下降，說明FSH在性腺發(fā)育和配子發(fā)生的早期起主要作用，而LH主要是調(diào)控性腺發(fā)育的最后成熟。本研究還成功地構(gòu)建了花鰻鱺GTHs的酵母表達(dá)載體，為今后表達(dá)出有生物活性的花鰻鱺促性腺激素，開展花鰻鱺神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)和人工繁殖研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 本作品以我國二級(jí)保護(hù)野生動(dòng)物—花鰻鱺為研究對(duì)象，通過克隆花鰻鱺的促性腺激素（GTHs）基因的cDNA，研究這些基因在其14種組織器官中表達(dá)情況；并研究GTHs在其性腺發(fā)育不同階段的mRNA表達(dá)特征，初步了解GTHs在花鰻鱺性腺發(fā)育與成熟過程中的生理功能；同時(shí)采用基因重組技術(shù)，構(gòu)建了GTHs的酵母表達(dá)載體，以表達(dá)出有生物活性的花鰻鱺促性腺激素，為鰻鱺人工繁殖提供新型的催熟催產(chǎn)劑。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 鰻鱺人工繁殖是世界性難題。成功地開展鰻鱺人工繁殖的關(guān)鍵之一是要有高效的催熟催產(chǎn)劑，以保證獲得高質(zhì)量的精子和卵子，從而提高受精率、孵化率和仔魚存活率。GTHs是調(diào)控魚類性腺發(fā)育與成熟的關(guān)鍵性內(nèi)分泌因子。本作品采用酵母表達(dá)體系表達(dá)酵母表達(dá)花鰻鱺GTHs，不僅在技術(shù)方法上先進(jìn)；而且，表達(dá)產(chǎn)物是花鰻鱺的生殖內(nèi)分泌因子中的重要因子，對(duì)于解決鰻鱺的人工繁殖問題有重要的理論指導(dǎo)意義和應(yīng)用價(jià)值。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 本作品通過克隆花鰻鱺的促性腺激素（GTHs）基因的cDNA，初步探討了GTHs在花鰻鱺性腺發(fā)育與成熟過程中的生理功能；并構(gòu)建了酵母表達(dá)體系，為下一步促性腺激素的重組表達(dá)打下基礎(chǔ)。獲得具有生物活性的花鰻鱺GTHs，不僅可用于花鰻鱺的生殖內(nèi)分泌學(xué)和人工繁殖研究，為解決鰻鱺人工繁殖問題提供基礎(chǔ)；也可利用于其他魚類的人工繁殖生產(chǎn)應(yīng)用，可作為新一代的魚類催熟催產(chǎn)劑，具有良好的應(yīng)用前景。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 克隆了花鰻鱺促性腺激素GTHs的3個(gè)亞基（GTHα、FSHβ、LHβ）基因的cDNA，GTHα cDNA全長(zhǎng)362bp，其中開放閱讀框長(zhǎng)351bp，編碼116個(gè)氨基酸，包括24個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、92個(gè)氨基酸的的成熟肽。FSHβ cDNA全長(zhǎng)458bp，其中開放閱讀框長(zhǎng)384bp，編碼127個(gè)氨基酸，包括22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、105個(gè)氨基酸的的成熟肽。LHβ cDNA全長(zhǎng)536bp，其中開放閱讀框長(zhǎng)423bp，編碼140個(gè)氨基酸，包括24個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、116個(gè)氨基酸的的成熟肽。通過Real-time PCR定量分析表明：花鰻鱺腦垂體中GTHα和LHβ mRNA水平在性腺發(fā)育成熟過程中不斷升高，而FSHβ mRNA水平在性腺發(fā)育早期較高，隨著性腺發(fā)育成熟不斷下降，說明FSH在性腺發(fā)育和配子發(fā)生的早期起主要作用，而LH主要是調(diào)控性腺發(fā)育的最后成熟。最后成功地構(gòu)建了花鰻鱺GTHs的酵母表達(dá)載體，為下一步GTHs的重組表達(dá)研究奠定了基礎(chǔ)。
獲獎(jiǎng)情況
- 該作品于2009年5月獲得某?！疤魬?zhàn)杯”大學(xué)生學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽特等獎(jiǎng)。
鑒定結(jié)果
參考文獻(xiàn)
- [1]袁瑛,閔志勇.花鰻鱺的基礎(chǔ)生物學(xué)研究[J].水產(chǎn)科學(xué),2005,24(9):29-31. [2]Kagawa et al. The first success of glass eel production in the world: basic biology on fish reproduction advances new applied technology in aquaculture[J]. Fish.Physiol.Biochem.,2005,31:193-199. [3]Hayakawa et al. Induction of spermatogenesis in Japanese eel by recombinant goldfish gonadotropins[J]. Fish.Sci.,2009,75:137-144. [4]Kamei et al. Expression of a biologically active recombinant follicle stimulating hormone of Japanese Eel Anguilla japonica using methylotropic yeast[J],Pichia pastoris. Gen.Comp.Endocrinol.,2003,162:192-202. [5]孫紅立等.畢赤酵母(Pichia pastoris) 分泌表達(dá)牛白細(xì)胞介素[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2004, 24(3):261-267.
同類課題研究水平概述
- 促性腺激素（GTH）是促進(jìn)性腺發(fā)育成熟的關(guān)鍵性激素。GTH是由2個(gè)亞基（GTH-a、GTH-β）組成的糖蛋白激素：促卵泡激素（FSH）由GTH-a與FSH-β亞基組成，促黃體激素（LH）由GTH-a與LH-β亞基組成。與其他脊椎動(dòng)物一樣，魚類的繁殖活動(dòng)受到腦-垂體-性腺軸的調(diào)控。下丘腦產(chǎn)生的促性腺激素釋放激素刺激二種類型的促性腺激素（FSH、LH）的合成與分泌；促性腺激素作用于性腺產(chǎn)生性類固醇激素，進(jìn)而調(diào)節(jié)性腺的發(fā)育成熟。 在養(yǎng)殖條件下，鰻鱺由于缺乏適合的生態(tài)環(huán)境，促性腺釋放激素和促性腺激素未能充分分泌和發(fā)揮作用，使得性腺發(fā)育成熟、排卵、排精等生理過程無法完成。注射魚類腦垂體或HCG已經(jīng)被成功用于誘導(dǎo)日本鰻鱺和歐洲鰻鱺的性腺發(fā)育成熟和產(chǎn)卵，但結(jié)果還不理想。這可能和這些異源促性腺激素不能完全代替同源促性腺激素的生理作用，造成性腺發(fā)育與成熟異常有關(guān)。如何獲得充足的同種鰻魚促性腺激素來誘導(dǎo)鰻魚性腺發(fā)育成熟與產(chǎn)卵是解決鰻鱺人工繁殖的關(guān)鍵之一?；蛑亟M技術(shù)和蛋白表達(dá)技術(shù)的快速發(fā)展使得表達(dá)各種魚類的促性腺激素并用來代替鯉魚腦垂體提取物已經(jīng)成為可能。在國外，魚類的促性腺激素基因重組表達(dá)已在幾種表達(dá)體系中成功表達(dá)；但在國內(nèi)還沒有研究報(bào)道。 花鰻鱺是我國名貴的經(jīng)濟(jì)魚類之一，其營養(yǎng)價(jià)值高，市場(chǎng)價(jià)格是日本鰻鱺、歐洲鰻鱺的3倍，而且市場(chǎng)需求大，養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景好。但花鰻鱺自然資源匱乏，又是國家保護(hù)動(dòng)物。當(dāng)前花鰻鱺的養(yǎng)殖苗種完全依賴于捕撈天然苗種，不僅會(huì)嚴(yán)重影響花鰻養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展，而且對(duì)花鰻鱺自然資源的保護(hù)與合理利用也會(huì)造成極大威脅。因此，開展花鰻鱺人工繁育研究勢(shì)在必行，但至今未見有關(guān)花鰻鱺生殖內(nèi)分泌調(diào)控的研究報(bào)道。根據(jù)日本鰻鱺人工繁殖研究取得的成果和經(jīng)驗(yàn)，解決花鰻鱺的人工繁育問題首先要了解花鰻鱺神經(jīng)生殖內(nèi)分泌學(xué)的特點(diǎn)，尤其是促性腺激素的作用特點(diǎn)與調(diào)控機(jī)制，然后設(shè)計(jì)科學(xué)合理的技術(shù)方案，采用有活性的同源促性腺激素誘導(dǎo)花鰻鱺性腺發(fā)育成熟與產(chǎn)卵。因此，本研究在國內(nèi)外首次提出用基因重組表達(dá)的花鰻鱺促性腺激素來誘導(dǎo)花鰻鱺性腺發(fā)育成熟。首先克隆了花鰻鱺促性腺激素基因cDNA，并對(duì)其組織分布與生理功能做了初步研究，還建立花鰻鱺促性腺激素酵母表達(dá)體系，為今后開展花鰻鱺的神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)和人工繁殖奠定基礎(chǔ)?？偟膩砜?，本作品的研究成果既具有較高的理論價(jià)值，又有很好的生產(chǎn)應(yīng)用前景。
