基本信息
- 項目名稱：
- 奶牛O157: H7大腸桿菌的快速檢測與分子流行病學研究
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術論文
- 簡介：
- 腸出血性大腸桿菌（EHEC）感染性腹瀉是近些年來新發(fā)現的危害嚴重的腸道傳染病，以O157: H7血清型大腸桿菌為最主要代表菌株。本研究基于EHEC O157: H7的志賀氏毒素1、志賀氏毒素2、緊密素、腸溶血素四個基因建立了多重PCR快速檢測方法。該體系可檢出10 CFU細菌，模擬樣品可達到2 CFU/g。運用該多重PCR方法配合選擇性增菌、分離培養(yǎng)和血清學試驗等檢測手段，了解O157: H7大腸桿菌在江蘇一牛群及其環(huán)境中的帶菌和流行情況。2008年1-12月間，共采集奶牛糞便及其環(huán)境等樣品共計2998份，最終獲得O157: H7分離株共計90株，分離率為3.0%。其中奶牛糞便樣的分離率為3.1%（45/1439）；犢牛糞便樣的分離率為4.2%（15/359）；奶牛體表分離率為0.8%（2/240）；飼料分離率為3.8%（9/240）；牧場飲水的分離率為1.3%（3/240）；肥料的分離率為1.3%（3/240）；泥漿的分離率為5.4%（13/240）。2008年1-12月份的分離率為1.2-6.0%，夏秋季分離率較高，其中6月份的陽性率最高，達到6.0%。同時所獲得O157: H7菌株的毒力相關基因的攜帶表現出一定的多態(tài)性。由此提示，可能奶牛是人感染EHEC的來源，也有可能通過接觸EHEC感染陽性的奶牛或者環(huán)境傳播給人。因此控制大腸桿菌EHEC在牛場環(huán)境中的存活與擴散，加強奶牛及其產品以及牧場環(huán)境中該類細菌的檢測，是防止人類發(fā)生EHEC感染的重要途徑之一。
- 詳細介紹：
- 腸出血性大腸桿菌（EHEC）感染性腹瀉是近些年來新發(fā)現的危害嚴重的腸道傳染病，以O157: H7血清型大腸桿菌為最主要代表菌株。它除引起人腹瀉、出血性腸炎外，還可發(fā)生溶血性尿毒綜合癥、血栓性血小板減少性紫癜等嚴重的并發(fā)癥，病死率高。O157: H7大腸桿菌是動物傳染性病原體，在動物中幾乎不致病，反芻動物是它們的主要自然宿主。其中牛為O157: H7的主要貯存宿主，它沒有任何癥狀卻能排泄這種病原體。在我國，奶牛及其產品中O157: H7感染正在受到日益廣泛而密切的關注，其對人的健康已構成了巨大威脅。 本研究基于O157: H7大腸桿菌的志賀毒素1、志賀毒素2、緊密素、腸溶血素四個基因建立了多重PCR快速檢測方法，該體系可檢出10 CFU細菌，模擬樣品可達到2 CFU/g。同國標常規(guī)培養(yǎng)法相比，通過實驗發(fā)現，用PCR技術和免疫磁珠技術相結合的方法檢測大腸桿菌O157: H7，利用PCR的快速鑒定技術，將檢測陽性的樣品通過免疫磁珠法進行分離鑒定。結果，陽性分離率由國標常規(guī)方法的1.4%提高到2.4%，說明此方法提高了大腸桿菌O157: H7的陽性分離率，這對于大腸桿菌O157: H7的監(jiān)測工作有很大幫助。同時由于檢測方法的簡便易操作和無特殊設備要求，使得本檢測方法便于在大型牛場推廣實施。 為了解O157: H7大腸桿菌在江蘇一牛群及其環(huán)境中的帶菌和流行情況。2008年1-12月間，共采集奶牛糞便及其環(huán)境等樣品共計2998份，最終獲得O157: H7分離株共計90株，分離率為3.0%。其中奶牛糞便樣的分離率為3.1%（45/1439）；犢牛糞便樣的分離率為4.2%（15/359）；奶牛體表分離率為0.8%（2/240）；飼料分離率為3.8%（9/240）；牧場飲水的分離率為1.3%（3/240）；肥料的分離率為1.3%（3/240）；泥漿的分離率為5.4%（13/240）。2008年1-12月份的分離率為1.2-6.0%，夏秋季分離率較高，其中6月份的陽性率最高，達到6.0%。選取來自于人源的O157: H7株（9株）以及分離的牛源O157: H7菌株（90株），對它們進行相關毒力基因的檢測。除了主要毒力基因stx1、stx2、eaeA、hlyA 外，還包括LEE毒力島中的其他基因（tir、espA等）以及菌體脂多糖基因（rfbE）、鞭毛基因（fliC）等16個基因。結果表明同一牧場分離的O157: H7血清型的菌株毒力基因不完全相同，主要分為3個型，其中以I型為主，占測試菌株的85.9%（85/99），同時這些分離到的O157: H7菌株攜帶的毒力相關基因表現出一定的多態(tài)性。由此提示，奶?？赡苁侨烁腥綞HEC的來源，也有可能通過接觸EHEC感染陽性的奶牛或者環(huán)境傳播給人。因此通過加強牛及其飼養(yǎng)環(huán)境的衛(wèi)生管理，實施定時監(jiān)測和控制EHEC在牛場環(huán)境中的存活與擴散，加強奶牛及其產品以及牧場環(huán)境中該類細菌的檢測，是防止人類發(fā)生EHEC感染的重要途徑之一。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 腸出血性大腸桿菌（EHEC）感染，尤其O157: H7大腸桿菌感染是近年來新發(fā)現的危害嚴重的腸道傳染病，已成為重要的公共衛(wèi)生問題。因此建立一種特異、靈敏、快速的O157: H7大腸桿菌檢測技術是防控腸出血性大腸桿菌感染的關鍵。本作品以奶牛及其環(huán)境作為研究對象，建立腸出血性大腸桿菌的快速檢測技術，對奶牛及其環(huán)境樣品的檢測，并作分子流行病學分析，以期為牛奶制品的食品安全防控提供理論基礎。
科學性、先進性及獨特之處
- 1、建立了簡便、快速、敏感性高的多重PCR體系檢測O157:H7大腸桿菌技術，分離率高，節(jié)約成本，適合推廣與應用； 2、對某牧場分子流行病學調查，發(fā)現同一牛群及其環(huán)境中EHEC以一種基因型為主，同時表現出一定多樣性，為控制EHEC在奶牛中感染提供了依據； 3、發(fā)現了EHEC可通過接觸EHEC感染陽性的奶?；颦h(huán)境傳播給人類，研究結果對人類防治EHEC具有重要意義。
應用價值和現實意義
- 作品建立多重PCR體系結合免疫磁珠分離檢測O157:H7大腸桿菌技術，可提高分離率，節(jié)約成本，為臨床監(jiān)測提供了一種簡便、快速、敏感的方法。 對江蘇一牛群及其環(huán)境中O157:H7的分子流行病學研究表明，EHEC可通過接觸EHEC感染陽性的奶?；颦h(huán)境傳播給人，這為防控EHEC在奶牛中的感染提供了重要依據。這一檢測技術對奶牛腸出血性大腸桿菌感染的綜合防治具有重要的現實意義。
學術論文摘要
- 牛為O157:H7的主要貯存宿主，它沒有任何癥狀卻能排泄這種病原體。在此情況下，奶牛及其產品中O157:H7感染正受到日益廣泛而密切的關注，其對人的健康已構成了巨大威脅。 研究基于O157:H7的志賀毒素1、志賀毒素2、緊密素、腸溶血素四個基因建立了多重PCR快速檢測方法，該體系可檢出10CFU細菌，模擬樣品可達到2CFU/g。同國標法相比，運用該PCR方法配合免疫磁珠分離培養(yǎng)等手段，可減輕工作量，節(jié)約成本，提高陽性分離率。 2008年1-12月間在一牛群及其環(huán)境中共采集奶牛糞便及其環(huán)境等樣品共計2998份，最終獲得O157:H7分離株共計90株，分離率為3.0%。2008年1-12月份的分離率為1.2-6.0%，夏秋季分離率較高，其中6月份的陽性率最高，達到6.0%。同時所獲得O157:H7菌株的毒力相關基因的攜帶表現出一定的多樣性。由此提示，奶?？赡苁侨烁腥綞HEC的來源，也有可能通過接觸EHEC感染陽性的奶?；蛘攮h(huán)境傳播給人。因此控制EHEC在牛場環(huán)境中的存活與擴散，加強奶牛及其產品和牧場環(huán)境中該類細菌的檢測，是防止人類發(fā)生EHEC感染的重要途徑。
獲獎情況
- 作品于2008年12月參加某大學第五屆“挑戰(zhàn)杯”大學生課外學術科技作品競賽，榮獲一等獎
鑒定結果
- 無
參考文獻
- [1] 陳祥, 崔一晨, 高崧, 等. 腸出血性大腸桿菌傳播模式. 中國人獸共患病學報. 2008, 24(6): 574-577 [2] 汪華. 腸出血性大腸桿菌O157:H7流行特征和控制對策研究. 醫(yī)學研究通訊. 2005, 34(05): 24-25 [3] Chen X, Gao S, Jiao X, et al. Prevalence of serogroups and virulence factors of Eschenchia coli strains isolated from pigs with postweaning diarrhea in eastern China. Vet. Microbiol. 2004, 103: 13-20 [4] Holland JL, Louie L, Simor AE, et al. PCR detection of Escherichia coli O157:H7 directly from stools: evaluation of commercial extraction methods for purifying fecal DNA. J. Clin. Microbiol. 2000, 38(11): 4108-4113 [5] Paton AW, Paton JC. Detection and characterization of shiga toxigenic Eschenchia coli by using multiplex PCR assays for stxl, stx2 enterhemorrhagic E. coil hlyA，rfbO1l1 and rfbO157. J. Clin. Microbiol. 1998, 36(2): 598-602 [6] Chapman PA, Siddons CA, Zadik RM, et al. An improved selective medium for isolation of Escherichia coli O157. J. Med. Microbiol. 1991, 35: 107-110
同類課題研究水平概述
- 腸出血性大腸桿菌（EHEC）感染性腹瀉是近年來新發(fā)現的危害嚴重的腸道傳染疾病，以O157：H7為最主要代表菌株。O157：H7除引起腹瀉、出血性腸炎外，還可發(fā)生溶血性尿毒綜合癥、血栓性血小板減少性紫癜等嚴重的并發(fā)征，病死率高，已引起各國的重視。自Riley（1982年）在美國的一起出血性腸炎暴發(fā)中首次分離到一種新型的屬于腸出血性大腸桿菌并可產生志賀毒素的O157：H7菌株以來，O157：H7疫情開始逐漸擴散和蔓延，相繼在英國、瑞典、澳大利亞、日本等多個國家和地區(qū)引起腹瀉暴發(fā)和流行，嚴重影響人類的生命健康。 O157：H7大腸桿菌是動物傳染性病原體，在動物中幾乎不致病，反芻動物是它們的主要自然宿主。其中牛為O157：H7的主要貯存宿主，它沒有任何癥狀卻能排泄這種病原體。我國奶牛中O157：H7感染正在受到日益廣泛而密切的關注，其對人們的健康構成了巨大威脅。在實際生產中，動物及其產品不可能免于O157：H7大腸桿菌的污染，微生物學實驗證實引起人感染O157：H7大腸桿菌的劑量極低，而目前已有的檢測方法如常規(guī)細菌分離法、免疫磁珠法、酶聯(lián)免疫吸附法、乳膠凝集試驗、膠體金免疫層析試紙檢測法、全自動酶聯(lián)熒光免疫分析儀篩選法、全自動病原菌檢測系統(tǒng)篩選法、基因芯片等，這些方法或檢出率低、或分離率低、或成本昂貴、或操作復雜，它們在快速易行、低成本與高分離率等方面還不能有效結合。因此需要建立一種簡便、快速、敏感性高的鑒別和診斷方法。 在世界范圍內，對O157：H7大腸桿菌的分離率研究從0.2%-16.6%不等。同時相關研究還發(fā)現O157：H7大腸桿菌在牛群中的流行也有一定的季節(jié)性，在溫暖氣候中糞便排泄物的分離率高的規(guī)律。病原體能在被糞便污染的水槽沉淀物中存活甚至生長，這可能也是牛長期攜帶和感染病原體的來源。EHEC在泥漿中的存留，增加了牛感染EHEC的機率，也成為人感染的一個潛在危險。牧場動物產生的廢料和污水，包括肥料和泥漿經常用作生長莊稼或牧草的肥料。這些產品中O157：H7的存留，可能成為EHEC在牛中的初始感染和重復感染的一個重要因素。在我國已有從人的散發(fā)病例中分離出O157：H7的報道，然而這些病例的病原和傳播途徑尚不清楚。從牛及其產品中分離出O157：H7大腸桿菌已有報道，但在奶牛群及其環(huán)境中，對O157：H7大腸桿菌的跟蹤調查和生態(tài)學研究較少。
