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基本信息

項(xiàng)目名稱(chēng)：
奶牛O157: H7大腸桿菌的快速檢測(cè)與分子流行病學(xué)研究
小類(lèi)：
生命科學(xué)
簡(jiǎn)介：
腸出血性大腸桿菌（EHEC）感染性腹瀉是近些年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的危害嚴(yán)重的腸道傳染病，以O(shè)157: H7血清型大腸桿菌為最主要代表菌株。本研究基于EHEC O157: H7的志賀氏毒素1、志賀氏毒素2、緊密素、腸溶血素四個(gè)基因建立了多重PCR快速檢測(cè)方法。該體系可檢出10 CFU細(xì)菌，模擬樣品可達(dá)到2 CFU/g。運(yùn)用該多重PCR方法配合選擇性增菌、分離培養(yǎng)和血清學(xué)試驗(yàn)等檢測(cè)手段，了解O157: H7大腸桿菌在江蘇一牛群及其環(huán)境中的帶菌和流行情況。2008年1-12月間，共采集奶牛糞便及其環(huán)境等樣品共計(jì)2998份，最終獲得O157: H7分離株共計(jì)90株，分離率為3.0%。其中奶牛糞便樣的分離率為3.1%（45/1439）；犢牛糞便樣的分離率為4.2%（15/359）；奶牛體表分離率為0.8%（2/240）；飼料分離率為3.8%（9/240）；牧場(chǎng)飲水的分離率為1.3%（3/240）；肥料的分離率為1.3%（3/240）；泥漿的分離率為5.4%（13/240）。2008年1-12月份的分離率為1.2-6.0%，夏秋季分離率較高，其中6月份的陽(yáng)性率最高，達(dá)到6.0%。同時(shí)所獲得O157: H7菌株的毒力相關(guān)基因的攜帶表現(xiàn)出一定的多態(tài)性。由此提示，可能奶牛是人感染EHEC的來(lái)源，也有可能通過(guò)接觸EHEC感染陽(yáng)性的奶?；蛘攮h(huán)境傳播給人。因此控制大腸桿菌EHEC在牛場(chǎng)環(huán)境中的存活與擴(kuò)散，加強(qiáng)奶牛及其產(chǎn)品以及牧場(chǎng)環(huán)境中該類(lèi)細(xì)菌的檢測(cè)，是防止人類(lèi)發(fā)生EHEC感染的重要途徑之一。
詳細(xì)介紹：
腸出血性大腸桿菌（EHEC）感染性腹瀉是近些年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的危害嚴(yán)重的腸道傳染病，以O(shè)157: H7血清型大腸桿菌為最主要代表菌株。它除引起人腹瀉、出血性腸炎外，還可發(fā)生溶血性尿毒綜合癥、血栓性血小板減少性紫癜等嚴(yán)重的并發(fā)癥，病死率高。O157: H7大腸桿菌是動(dòng)物傳染性病原體，在動(dòng)物中幾乎不致病，反芻動(dòng)物是它們的主要自然宿主。其中牛為O157: H7的主要貯存宿主，它沒(méi)有任何癥狀卻能排泄這種病原體。在我國(guó)，奶牛及其產(chǎn)品中O157: H7感染正在受到日益廣泛而密切的關(guān)注，其對(duì)人的健康已構(gòu)成了巨大威脅。 本研究基于O157: H7大腸桿菌的志賀毒素1、志賀毒素2、緊密素、腸溶血素四個(gè)基因建立了多重PCR快速檢測(cè)方法，該體系可檢出10 CFU細(xì)菌，模擬樣品可達(dá)到2 CFU/g。同國(guó)標(biāo)常規(guī)培養(yǎng)法相比，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用PCR技術(shù)和免疫磁珠技術(shù)相結(jié)合的方法檢測(cè)大腸桿菌O157: H7，利用PCR的快速鑒定技術(shù)，將檢測(cè)陽(yáng)性的樣品通過(guò)免疫磁珠法進(jìn)行分離鑒定。結(jié)果，陽(yáng)性分離率由國(guó)標(biāo)常規(guī)方法的1.4%提高到2.4%，說(shuō)明此方法提高了大腸桿菌O157: H7的陽(yáng)性分離率，這對(duì)于大腸桿菌O157: H7的監(jiān)測(cè)工作有很大幫助。同時(shí)由于檢測(cè)方法的簡(jiǎn)便易操作和無(wú)特殊設(shè)備要求，使得本檢測(cè)方法便于在大型牛場(chǎng)推廣實(shí)施。 為了解O157: H7大腸桿菌在江蘇一牛群及其環(huán)境中的帶菌和流行情況。2008年1-12月間，共采集奶牛糞便及其環(huán)境等樣品共計(jì)2998份，最終獲得O157: H7分離株共計(jì)90株，分離率為3.0%。其中奶牛糞便樣的分離率為3.1%（45/1439）；犢牛糞便樣的分離率為4.2%（15/359）；奶牛體表分離率為0.8%（2/240）；飼料分離率為3.8%（9/240）；牧場(chǎng)飲水的分離率為1.3%（3/240）；肥料的分離率為1.3%（3/240）；泥漿的分離率為5.4%（13/240）。2008年1-12月份的分離率為1.2-6.0%，夏秋季分離率較高，其中6月份的陽(yáng)性率最高，達(dá)到6.0%。選取來(lái)自于人源的O157: H7株（9株）以及分離的牛源O157: H7菌株（90株），對(duì)它們進(jìn)行相關(guān)毒力基因的檢測(cè)。除了主要毒力基因stx1、stx2、eaeA、hlyA 外，還包括LEE毒力島中的其他基因（tir、espA等）以及菌體脂多糖基因（rfbE）、鞭毛基因（fliC）等16個(gè)基因。結(jié)果表明同一牧場(chǎng)分離的O157: H7血清型的菌株毒力基因不完全相同，主要分為3個(gè)型，其中以I型為主，占測(cè)試菌株的85.9%（85/99），同時(shí)這些分離到的O157: H7菌株攜帶的毒力相關(guān)基因表現(xiàn)出一定的多態(tài)性。由此提示，奶?？赡苁侨烁腥綞HEC的來(lái)源，也有可能通過(guò)接觸EHEC感染陽(yáng)性的奶?；蛘攮h(huán)境傳播給人。因此通過(guò)加強(qiáng)牛及其飼養(yǎng)環(huán)境的衛(wèi)生管理，實(shí)施定時(shí)監(jiān)測(cè)和控制EHEC在牛場(chǎng)環(huán)境中的存活與擴(kuò)散，加強(qiáng)奶牛及其產(chǎn)品以及牧場(chǎng)環(huán)境中該類(lèi)細(xì)菌的檢測(cè)，是防止人類(lèi)發(fā)生EHEC感染的重要途徑之一。

作品專(zhuān)業(yè)信息

撰寫(xiě)目的和基本思路

腸出血性大腸桿菌（EHEC）感染，尤其O157: H7大腸桿菌感染是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的危害嚴(yán)重的腸道傳染病，已成為重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。因此建立一種特異、靈敏、快速的O157: H7大腸桿菌檢測(cè)技術(shù)是防控腸出血性大腸桿菌感染的關(guān)鍵。本作品以奶牛及其環(huán)境作為研究對(duì)象，建立腸出血性大腸桿菌的快速檢測(cè)技術(shù)，對(duì)奶牛及其環(huán)境樣品的檢測(cè)，并作分子流行病學(xué)分析，以期為牛奶制品的食品安全防控提供理論基礎(chǔ)。

科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處

1、建立了簡(jiǎn)便、快速、敏感性高的多重PCR體系檢測(cè)O157:H7大腸桿菌技術(shù)，分離率高，節(jié)約成本，適合推廣與應(yīng)用； 2、對(duì)某牧場(chǎng)分子流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)同一牛群及其環(huán)境中EHEC以一種基因型為主，同時(shí)表現(xiàn)出一定多樣性，為控制EHEC在奶牛中感染提供了依據(jù)； 3、發(fā)現(xiàn)了EHEC可通過(guò)接觸EHEC感染陽(yáng)性的奶?；颦h(huán)境傳播給人類(lèi)，研究結(jié)果對(duì)人類(lèi)防治EHEC具有重要意義。

應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義

作品建立多重PCR體系結(jié)合免疫磁珠分離檢測(cè)O157:H7大腸桿菌技術(shù)，可提高分離率，節(jié)約成本，為臨床監(jiān)測(cè)提供了一種簡(jiǎn)便、快速、敏感的方法。 對(duì)江蘇一牛群及其環(huán)境中O157:H7的分子流行病學(xué)研究表明，EHEC可通過(guò)接觸EHEC感染陽(yáng)性的奶牛或環(huán)境傳播給人，這為防控EHEC在奶牛中的感染提供了重要依據(jù)。這一檢測(cè)技術(shù)對(duì)奶牛腸出血性大腸桿菌感染的綜合防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

學(xué)術(shù)論文摘要

牛為O157:H7的主要貯存宿主，它沒(méi)有任何癥狀卻能排泄這種病原體。在此情況下，奶牛及其產(chǎn)品中O157:H7感染正受到日益廣泛而密切的關(guān)注，其對(duì)人的健康已構(gòu)成了巨大威脅。 研究基于O157:H7的志賀毒素1、志賀毒素2、緊密素、腸溶血素四個(gè)基因建立了多重PCR快速檢測(cè)方法，該體系可檢出10CFU細(xì)菌，模擬樣品可達(dá)到2CFU/g。同國(guó)標(biāo)法相比，運(yùn)用該P(yáng)CR方法配合免疫磁珠分離培養(yǎng)等手段，可減輕工作量，節(jié)約成本，提高陽(yáng)性分離率。 2008年1-12月間在一牛群及其環(huán)境中共采集奶牛糞便及其環(huán)境等樣品共計(jì)2998份，最終獲得O157:H7分離株共計(jì)90株，分離率為3.0%。2008年1-12月份的分離率為1.2-6.0%，夏秋季分離率較高，其中6月份的陽(yáng)性率最高，達(dá)到6.0%。同時(shí)所獲得O157:H7菌株的毒力相關(guān)基因的攜帶表現(xiàn)出一定的多樣性。由此提示，奶?？赡苁侨烁腥綞HEC的來(lái)源，也有可能通過(guò)接觸EHEC感染陽(yáng)性的奶?；蛘攮h(huán)境傳播給人。因此控制EHEC在牛場(chǎng)環(huán)境中的存活與擴(kuò)散，加強(qiáng)奶牛及其產(chǎn)品和牧場(chǎng)環(huán)境中該類(lèi)細(xì)菌的檢測(cè)，是防止人類(lèi)發(fā)生EHEC感染的重要途徑。

獲獎(jiǎng)情況

作品于2008年12月參加某大學(xué)第五屆“挑戰(zhàn)杯”大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽，榮獲一等獎(jiǎng)

鑒定結(jié)果

無(wú)

參考文獻(xiàn)

[1] 陳祥, 崔一晨, 高崧, 等. 腸出血性大腸桿菌傳播模式. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào). 2008, 24(6): 574-577 [2] 汪華. 腸出血性大腸桿菌O157:H7流行特征和控制對(duì)策研究. 醫(yī)學(xué)研究通訊. 2005, 34(05): 24-25 [3] Chen X, Gao S, Jiao X, et al. Prevalence of serogroups and virulence factors of Eschenchia coli strains isolated from pigs with postweaning diarrhea in eastern China. Vet. Microbiol. 2004, 103: 13-20 [4] Holland JL, Louie L, Simor AE, et al. PCR detection of Escherichia coli O157:H7 directly from stools: evaluation of commercial extraction methods for purifying fecal DNA. J. Clin. Microbiol. 2000, 38(11): 4108-4113 [5] Paton AW, Paton JC. Detection and characterization of shiga toxigenic Eschenchia coli by using multiplex PCR assays for stxl, stx2 enterhemorrhagic E. coil hlyA，rfbO1l1 and rfbO157. J. Clin. Microbiol. 1998, 36(2): 598-602 [6] Chapman PA, Siddons CA, Zadik RM, et al. An improved selective medium for isolation of Escherichia coli O157. J. Med. Microbiol. 1991, 35: 107-110

同類(lèi)課題研究水平概述

腸出血性大腸桿菌（EHEC）感染性腹瀉是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的危害嚴(yán)重的腸道傳染疾病，以O(shè)157：H7為最主要代表菌株。O157：H7除引起腹瀉、出血性腸炎外，還可發(fā)生溶血性尿毒綜合癥、血栓性血小板減少性紫癜等嚴(yán)重的并發(fā)征，病死率高，已引起各國(guó)的重視。自Riley（1982年）在美國(guó)的一起出血性腸炎暴發(fā)中首次分離到一種新型的屬于腸出血性大腸桿菌并可產(chǎn)生志賀毒素的O157：H7菌株以來(lái)，O157：H7疫情開(kāi)始逐漸擴(kuò)散和蔓延，相繼在英國(guó)、瑞典、澳大利亞、日本等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)引起腹瀉暴發(fā)和流行，嚴(yán)重影響人類(lèi)的生命健康。 O157：H7大腸桿菌是動(dòng)物傳染性病原體，在動(dòng)物中幾乎不致病，反芻動(dòng)物是它們的主要自然宿主。其中牛為O157：H7的主要貯存宿主，它沒(méi)有任何癥狀卻能排泄這種病原體。我國(guó)奶牛中O157：H7感染正在受到日益廣泛而密切的關(guān)注，其對(duì)人們的健康構(gòu)成了巨大威脅。在實(shí)際生產(chǎn)中，動(dòng)物及其產(chǎn)品不可能免于O157：H7大腸桿菌的污染，微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)引起人感染O157：H7大腸桿菌的劑量極低，而目前已有的檢測(cè)方法如常規(guī)細(xì)菌分離法、免疫磁珠法、酶聯(lián)免疫吸附法、乳膠凝集試驗(yàn)、膠體金免疫層析試紙檢測(cè)法、全自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫分析儀篩選法、全自動(dòng)病原菌檢測(cè)系統(tǒng)篩選法、基因芯片等，這些方法或檢出率低、或分離率低、或成本昂貴、或操作復(fù)雜，它們?cè)诳焖僖仔?、低成本與高分離率等方面還不能有效結(jié)合。因此需要建立一種簡(jiǎn)便、快速、敏感性高的鑒別和診斷方法。 在世界范圍內(nèi)，對(duì)O157：H7大腸桿菌的分離率研究從0.2%-16.6%不等。同時(shí)相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)O157：H7大腸桿菌在牛群中的流行也有一定的季節(jié)性，在溫暖氣候中糞便排泄物的分離率高的規(guī)律。病原體能在被糞便污染的水槽沉淀物中存活甚至生長(zhǎng)，這可能也是牛長(zhǎng)期攜帶和感染病原體的來(lái)源。EHEC在泥漿中的存留，增加了牛感染EHEC的機(jī)率，也成為人感染的一個(gè)潛在危險(xiǎn)。牧場(chǎng)動(dòng)物產(chǎn)生的廢料和污水，包括肥料和泥漿經(jīng)常用作生長(zhǎng)莊稼或牧草的肥料。這些產(chǎn)品中O157：H7的存留，可能成為EHEC在牛中的初始感染和重復(fù)感染的一個(gè)重要因素。在我國(guó)已有從人的散發(fā)病例中分離出O157：H7的報(bào)道，然而這些病例的病原和傳播途徑尚不清楚。從牛及其產(chǎn)品中分離出O157：H7大腸桿菌已有報(bào)道，但在奶牛群及其環(huán)境中，對(duì)O157：H7大腸桿菌的跟蹤調(diào)查和生態(tài)學(xué)研究較少。
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