基本信息
- 項目名稱：
- 病源微生物稻瘟菌激發(fā)子幾丁質(zhì)酶與受體甘露糖凝集素互作研究
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術論文
- 簡介：
- 水稻是世界三大糧食作物之一，同時作為我國主要的糧食作物，卻深受稻瘟病的危害，稻瘟病是限制水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要因素。對稻瘟菌的發(fā)病機制進行研究具有重要意義，同時對稻瘟病的防治也一直是研究的重點和難點。本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到與稻瘟病菌激發(fā)子（幾丁質(zhì)酶）互作的受體。通過體外的GST沉淀驗證相互作用的特異性。再將陽性克隆子測序，通過生物信息學來預測受體蛋白的結(jié)構以及結(jié)構和功能之間的關系。最后通過生物學功能分析來明確激發(fā)子蛋白與受體蛋白的結(jié)構與功能的互作關系。從而揭示水稻與稻瘟病菌相互作用的分子機制，把寄主-病源物相互識別的研究推向一個新的階段。
- 詳細介紹：
- 本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng)以稻瘟菌激發(fā)子(幾丁質(zhì)酶)作為誘餌蛋白，從水稻cDNA文庫中篩選到激發(fā)子受體。把誘餌蛋白幾丁質(zhì)酶基因與含有His的表達載體pET-32a構建重組載體，把受體蛋白基因與含有GST的表達載體pGEX-KG構建重組載體。驗證重組載體構建成功后，誘導其表達蛋白，收集誘餌蛋白幾丁質(zhì)酶和靶蛋白甘露糖凝集素，通過GST pull down來驗證激發(fā)子與受體蛋白相互作用的特異性。在體外驗證它們確實存在互作后，對受體進行生物學分析，構建不同的突變體來進一步明確激發(fā)子蛋白與受體蛋白的互作關系。根據(jù)糖結(jié)合位點的位置構建了帶有GST標簽的四個不同突變體，突變體構建成功后，誘導其表達蛋白，收集并純化蛋白，分別與幾丁質(zhì)酶進行GST pull down ，收集洗脫液進行Western Blotting檢測。分析實驗數(shù)據(jù)后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)受體83-94位間的糖結(jié)合位點在甘露糖凝集素與稻瘟菌幾丁質(zhì)酶互作中起著關鍵作用，而其他兩個糖結(jié)合位點都不是必須的，但可能起輔助作用。本實驗得出的結(jié)論對弄清激發(fā)子與受體間的互作關系，揭示水稻與稻瘟病菌相互作用的分子機制具有重要意義，同時也可以為利用這些基因進行水稻轉(zhuǎn)基因抗病育種奠定基礎，對于水稻抗病品種的改良和新型高效、無公害生物農(nóng)藥的研制也將提供可靠的理論依據(jù)。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：植物病源微生物激發(fā)子及其受體的研究是一個新領域，開展激發(fā)子受體的研究工作，有助于深入了解稻瘟菌—水稻間的相互識別，闡明水稻對稻瘟病菌的抗性機制和水稻與稻瘟病菌互作的分子機理。 基本思路：本研究通過酵母雙雜交篩選稻瘟菌激發(fā)子的受體，通過體外的GST pull down進一步驗證激發(fā)子與受體的互作。通過生物信息學分析受體的結(jié)構。在生物信息分析的基礎上，進一步研究受體與激發(fā)子互作的分子機制。
科學性、先進性及獨特之處
- 科學性、先進性：本研究在篩選到受體后還進一步從體外對篩選到的受體進行驗證，且充分利用了生物信息學的知識對受體進行分析，且構建不同突變體進一步研究激發(fā)子與受體互作的分子機制。該作品取得的實驗結(jié)果，通過聯(lián)網(wǎng)檢索，未見相同報道。 獨特之處：在水稻和稻瘟菌全基因測序完成的基礎之上，全面地分析受體蛋白結(jié)構及其生物學功能，明確其互作關系。未見相同報道。
應用價值和現(xiàn)實意義
- 該作品的結(jié)果可以初步揭示水稻與稻瘟病菌相互作用的分子機制，為稻瘟病的生物學防治奠定基礎，把寄主—病源物相互識別的研究推向一個新的階段。同時也可以為利用這些基因進行水稻轉(zhuǎn)基因抗病育種奠定基礎，對于水稻抗病品種的改良和新型高效、無公害生物農(nóng)藥的研制也將提供可靠的理論依據(jù)。
學術論文摘要
- 意義：病源微生物激發(fā)子與受體相互作用的研究，有助于弄清病原微生物侵染宿主的分子機制。思路：用稻瘟病幾丁質(zhì)酶作為病源微生物激發(fā)子，利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與稻瘟病菌激發(fā)子互作的受體，并研究受體的功能。實驗路線：利用酵母雙雜交系統(tǒng)以稻瘟菌激發(fā)子作為誘餌蛋白，從實驗室構建的水稻的cDNA文庫中篩選激發(fā)子受體，先把誘餌蛋白幾丁質(zhì)酶與含有His表達載體pET-32a進行融合表達，把受體蛋白與含有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)的表達載體pGEX-KG進行融合表達。構建好載體后分別誘導表達含有這種親合標簽的融合蛋白，進行GST pull down 驗證相互作用的特異性。最后對受體進行生物信息學分析，構建不同的受體突變體來明確激發(fā)子蛋白與受體蛋白的結(jié)構與功能的互作關系。結(jié)果：篩選到稻瘟菌幾丁質(zhì)酶的一個受體-甘露糖凝集素(Osmbl)，并體外驗證它們存在互作，且通過生物信息學對受體進行分析，并構建了四個不同突變體，誘導表達蛋白進行GST pull down，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了受體83-94位間的糖結(jié)合位點在甘露糖凝集素與稻瘟菌幾丁質(zhì)酶互作中起著關鍵作用，而其他兩個糖結(jié)合位點都不是必須，但可能起輔助作用。
獲獎情況
- 2008年入選校級大學生創(chuàng)新性實驗計劃項目 2008年入選省級大學生創(chuàng)新性實驗計劃項目 2009年獲“挑戰(zhàn)杯”省級大學生課外學術科技作品競賽“特等獎”
鑒定結(jié)果
參考文獻
- 酵母雙雜交技術、GST pull-down、Western blotting、分子克隆技術等。 [1] Willy J, et a1．Analysis of the sugar-binding specificity of mannose-binding-type Jacalin-related lectins by frontal affinity chromatography – an approach to functional classification.The FEBS Journal 275 (2008) 1227–1239. [2] Abel Garcia-Pino, et al． How a Plant Lectin Recognizes High Mannose Oligosaccharides.Plant Physiology, August 2007, Vol. 144, pp. 1733–1741. [3] Jun Fang, et al．Mutations of genes in synthesis of the carotenoid precursors of ABA lead to pre-harvest sprouting and photo-oxidation in rice.The Plant Journal (2008) 54, 177–189. [4] Xinai Zhao, et al．OsTDL1A binds to the LRR domain of rice receptor kinase MSP1, and is required to limit sporocyte numbers.The Plant Journal (2008) 54, 375–387.
同類課題研究水平概述
- 已證實寡糖、幾丁質(zhì)、糖蛋白、蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸等在水稻與稻瘟病菌互作關系中具有激發(fā)子的活性。在稻瘟病菌中，已經(jīng)克隆MPG1、CUT1、Avr-pita、PWL2等十幾個致病性基因和無毒基因。MPG1基因是第一個被克隆的稻瘟病菌致病因子，其產(chǎn)物與細胞表面識別有關。CUT1基因編碼某種角質(zhì)酶，與菌絲穿透寄主角質(zhì)層有關。Sweigard等利用定位法從稻瘟病菌（Guy 11）中克隆了無毒基因PWL2，該基因與對彎葉畫眉草（Eragrostis curvula）的致病性相關。Kanoh等從稻瘟病菌中分離純化了一種25 kDa的糖蛋白激發(fā)子，可誘導O2－的產(chǎn)生；而Schaffrath等所分離純化的另一種15.6 kDa的糖蛋白激發(fā)子，則可誘導木質(zhì)素的產(chǎn)生。國內(nèi)華南農(nóng)業(yè)大學報道，從稻瘟菌細胞壁中分離到的水溶性激發(fā)子GP66，可誘導水稻葉片過氧化物酶與苯丙氨酸解氨酶活性增強；隨后又從稻瘟病菌菌株97-151a細胞壁中分離純化出水溶性的糖蛋白CSBI，具有誘導水稻重要防御酶活性的激發(fā)子功能。 目前，在植物與病原菌互作系統(tǒng)中已發(fā)現(xiàn)了許多蛋白類激發(fā)子，Chan等從稻瘟菌侵染的cDNA文庫中克隆到與誘導水稻產(chǎn)生防衛(wèi)反應有關的Oschib1基因，該基因可能是與水稻致病相關的蛋白8家族的成員之一。Takashi等從稻瘟菌附著胞的消減cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)某一新的芽管特異基因CBP1，推測其編碼一種胞外幾丁質(zhì)酶，且可能與附著胞表面疏水性有關。Giaver等從釀酒酵母中克隆到與孢子的形成有關的幾丁質(zhì)酶基因，其缺失會導致孢子壁、成熟的子囊無法形成。Liu等發(fā)現(xiàn)具有很強的抗真菌活性的幾丁質(zhì)內(nèi)切酶基因ech42。 本作品篩選到激發(fā)子（幾丁質(zhì)酶）的受體（甘露糖凝集素），及其受體互作的研究，未見相同報道。
