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基本信息
- 項目名稱：
- 基于熒光蛋白標(biāo)簽的“夾心法”重組蛋白生產(chǎn)分離純化系統(tǒng)
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 大類：
- 科技發(fā)明制作B類
- 簡介：
- 我們發(fā)明的蛋白表達(dá)純化系統(tǒng)是一種基于熒光蛋白的“夾心法”標(biāo)簽表達(dá)純化系統(tǒng)。本發(fā)明的蛋白表達(dá)純化系統(tǒng)，是將目的蛋白的兩端，在N端連接一個新型熒光蛋白sGFP標(biāo)簽，在C端連接上一個組氨酸His短肽，并加有多核苷酸酶切位點，蛋白全長融合表達(dá)。同時可以根據(jù)需要在目的蛋白與標(biāo)簽之間加入蛋白酶切位點。該系統(tǒng)的目的蛋白表達(dá)效率能夠得到改進，提高目的蛋白產(chǎn)率，全長蛋白在可見光下為綠色，可以實施監(jiān)測蛋白表達(dá)效果、純化過程；僅通過肉眼監(jiān)視蛋白的表達(dá)效率、斷裂程度及純化流程。
- 詳細(xì)介紹：
- 熒光蛋白有許多優(yōu)良特性,如非外源因子依賴發(fā)光,無種屬依賴性,非常高的穩(wěn)定性,對生物體無毒性,可傳代進行遺傳分析,因而熒光蛋白在遺傳學(xué),發(fā)育生物學(xué),神經(jīng)生物學(xué)等學(xué)科都有著非常廣泛的應(yīng)用。因此針對現(xiàn)有的蛋白純化體系中使用的標(biāo)簽無法實時指示目標(biāo)蛋白在（大腸桿菌菌株中）表達(dá)、純化中的情況，蛋白純化實驗周期長，可控性差的問題，我們由熒光蛋白的一系列良好特性得到啟發(fā)，利用新型熒光蛋白superfold Green Fluorescnt Protein (sGFP) 構(gòu)建保有傳統(tǒng)標(biāo)簽優(yōu)點的可視化的生物反應(yīng)器，打開蛋白工程的“暗箱”，將所構(gòu)建的具有優(yōu)良特性的蛋白純化體系用于生命科學(xué)相關(guān)研究和應(yīng)用。 另外，在目前的生物實驗教學(xué)中，存在著如實驗周期長、實驗趣味性不高、實驗操作流程不明確等問題，因此降低了生物實驗對幫助學(xué)生加深理論基礎(chǔ)認(rèn)識的作用有限，同時由于本身趣味性、科普性不強，不能使現(xiàn)代蛋白質(zhì)表達(dá)純化技術(shù)被專業(yè)外的學(xué)生了解和知曉。隨著我們構(gòu)建的該系統(tǒng)的逐步完善，發(fā)現(xiàn)通過熒光蛋白進行可視化監(jiān)控的蛋白表達(dá)純化系統(tǒng)能在某些程度上解決如上的一些問題。經(jīng)過相關(guān)的了解，我們的系統(tǒng)可以在生化實驗、基因工程實驗等教學(xué)使用中，通過全程的可視化示蹤降低實驗的難度，提高學(xué)生興趣，能讓同學(xué)們較快理解蛋白表達(dá)純化的全過程及其原理。
作品圖片
作品專業(yè)信息
設(shè)計、發(fā)明的目的和基本思路、創(chuàng)新點、技術(shù)關(guān)鍵和主要技術(shù)指標(biāo)
- 一、設(shè)計發(fā)明目的和基本思路： 針對現(xiàn)有的蛋白純化體系中使用的標(biāo)簽無法實時指示目標(biāo)蛋白在表達(dá)、純化中的情況，同時為了避免蛋白純化實驗周期長，可控性差的問題，我們由熒光蛋白的一系列良好特性得到啟發(fā)，利用新型超級折疊綠色熒光蛋白熒光蛋白構(gòu)建保有傳統(tǒng)接頭優(yōu)點的可視化的生物反應(yīng)器，將所構(gòu)建的具有優(yōu)良特性的蛋白純化體系用于生命科學(xué)相關(guān)研究和應(yīng)用。而在教學(xué)應(yīng)用方面，我們的系統(tǒng)也可應(yīng)用在生化、基因工程等教學(xué)使用中，通過全程的可視化示蹤降低實驗的難度，提高實驗趣味性，能讓同學(xué)們較快理解蛋白表達(dá)純化的全過程及其原理。 二、創(chuàng)新點（具體參見下表“科學(xué)性先進性”）： 對于基因工程重組蛋白的表達(dá)、分離和純化的“黑箱操作”問題，本作品提出了一種很好的解決辦法，使得融合蛋白的表達(dá)、純化進程變得可視可控，實驗者可迅速作出判斷而無需依賴SDS-PAGE等一系列非常耗時的后續(xù)檢測實驗；而本作品中使用的熒光蛋白標(biāo)簽 + 目的蛋白 + 多聚組氨酸標(biāo)簽的雙指示“夾心法”表達(dá)純化體系使融合蛋白的表達(dá)過程直觀顯現(xiàn)，同時顯著增加表達(dá)產(chǎn)量，使得整個實驗流程速度加快，成功率也大大提高。 三、技術(shù)關(guān)鍵和主要技術(shù)指標(biāo)： 利用本系統(tǒng)進行蛋白質(zhì)原核表達(dá)和純化，在蛋白質(zhì)產(chǎn)量、純度、生物活性、實驗操作難易度、實驗過程的可視可控性、實驗成本等方面與傳統(tǒng)標(biāo)簽的蛋白質(zhì)表達(dá)純化系統(tǒng)進行綜合比較，各項指標(biāo)均優(yōu)于傳統(tǒng)標(biāo)簽的蛋白表達(dá)、純化系統(tǒng)。
科學(xué)性、先進性
- 1.過程可視可控。首次嘗試將熒光蛋白作為增溶接頭使用并成功應(yīng)用，在保持傳統(tǒng)增溶接頭優(yōu)點的同時利用熒光蛋白良好的非外源因子依賴發(fā)光特性使實驗的過程變得可視可控，提前知道蛋白表達(dá)的情況怎么樣，是否斷裂表達(dá)嚴(yán)重，從柱上分步洗脫的時候在哪幾管里，我們不僅能提高我們的實驗效率，加速我們的實驗進度，還能從經(jīng)濟上節(jié)約實驗成本。 2.綜合性能優(yōu)異。相比其他種類的熒光蛋白，07年報道的新型熒光蛋白sGFP的溶解性很好，穩(wěn)定程度更高，并且能幫助融合表達(dá)的目標(biāo)蛋白正確折疊，進一步提高了融合蛋白的溶解度和活性，使得我們構(gòu)建的蛋白純化體系不僅在增溶效果、蛋白活性高低等各項性能不輸傳統(tǒng)的蛋白純化體系，而且擁有了可視的特性。 3.雙接頭指示，純化過程更直觀。將sGFP于目標(biāo)蛋白N端，His接頭于C端在大腸桿菌Rossetta表達(dá)菌株中融合表達(dá)，再將菌液上清通過鎳柱富集蛋白。由于只有全長表達(dá)的融合蛋白才能結(jié)合到鎳柱上的同時發(fā)射熒光，因此全長表達(dá)的融合蛋白量的多少可以通過目測直接判斷，在后續(xù)純化實驗中也方便跟蹤。
獲獎情況及鑒定結(jié)果
- 一、2009年5月中國遺傳學(xué)會副理事長余龍教授出具推薦信一封。 二、2009年5月國家教育部生物科學(xué)與工程教學(xué)指導(dǎo)委員會副主任、生物科學(xué)專業(yè)分委員會主任、復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院原教學(xué)副院長喬守怡教授對本項目給予了極高評價，并出具了本項目適合在教學(xué)中推廣的應(yīng)用證明。
作品所處階段
- 中試階段
技術(shù)轉(zhuǎn)讓方式
- 無
作品可展示的形式
- 實物、產(chǎn)品,現(xiàn)場演示,錄像
使用說明,技術(shù)特點和優(yōu)勢,適應(yīng)范圍,推廣前景的技術(shù)性說明,市場分析,經(jīng)濟效益預(yù)測
- 一、技術(shù)特點和優(yōu)勢 熒光蛋白標(biāo)簽亮度高，穩(wěn)定，可視化，性質(zhì)穩(wěn)定，助折疊，提高目的蛋白溶解性等特點；雙標(biāo)簽“夾心法”設(shè)計指示蛋白的斷裂表達(dá)情況；His標(biāo)簽長度根據(jù)純化條件可任意調(diào)整；便于目的蛋白替換，操作便捷；實時監(jiān)控，節(jié)省時間和經(jīng)費；可規(guī)?；a(chǎn)業(yè)化，成批操作，帶來可觀經(jīng)濟效益。 二、適用范圍 廣泛適用于重組蛋白的表達(dá)，分離和純化，可以用于生物醫(yī)藥，工業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究等多方面，還可以用于蛋白表達(dá)純化、基因工程等教學(xué)實驗。 三、市場分析和經(jīng)濟效益預(yù)測 能夠?qū)崟r監(jiān)控蛋白的表達(dá)情況，碰到問題可于第一時間中止實驗，以減少不必要的時間延誤和經(jīng)費損失。對商業(yè)生產(chǎn)中一些難以表達(dá)的蛋白具有一定的幫助。純化時能夠?qū)崟r跟蹤目的蛋白走向，對操作人員不需要高的技術(shù)背景及水平要求，重復(fù)性和穩(wěn)定性能進一步保證產(chǎn)業(yè)化的實現(xiàn)。設(shè)計有多核苷酸酶切位點，方便目的蛋白的替換，操作簡易，廣泛應(yīng)用性強，利于拓展?jié)撛谑袌觥?/dd>
同類課題研究水平概述
- 隨著蛋白質(zhì)-組學(xué)研究的深入，將待研究蛋白與增溶標(biāo)簽進行融合表達(dá)和純化已經(jīng)成為常規(guī)手段。而由于熒光蛋白相關(guān)的研究開展不久，尤其是新型熒光蛋白sGFP的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用在最近一兩年才開始，因此我們與國際領(lǐng)先水平站在同一起跑線上。 目前國際上對目的蛋白前后接多個Tag的很多，如His, MBP, GST等，但是具體應(yīng)用至商業(yè)化生產(chǎn)上的的不算多，而國內(nèi)用多標(biāo)簽進行商業(yè)化生產(chǎn)幾乎沒有。將新型熒光蛋白sGFP和His作為雙標(biāo)簽、“夾心法”運用于蛋白商業(yè)生產(chǎn)則未見報道。 熒光蛋白目前被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的各個領(lǐng)域，2008年諾貝爾化學(xué)獎授予在熒光蛋白上有突出貢獻的三位科學(xué)家后，熒光蛋白成為了生物大分子中的“明星分子”。但是熒光蛋白的應(yīng)用多在理論研究上面，無論在國內(nèi)外應(yīng)用于商業(yè)生產(chǎn)上還不多。新型熒光蛋白sGFP的應(yīng)用更是剛剛起步，我們將在發(fā)展已有研究基礎(chǔ)的技術(shù)平臺的基礎(chǔ)上，力爭在多方面有所創(chuàng)新。
