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基本信息
- 項(xiàng)目名稱(chēng)：
- 創(chuàng)建可消化纖維素的轉(zhuǎn)基因家蠶
- 來(lái)源：
- 第十一屆“挑戰(zhàn)杯”國(guó)賽作品
- 小類(lèi)：
- 生命科學(xué)
- 大類(lèi)：
- 自然科學(xué)類(lèi)學(xué)術(shù)論文
- 簡(jiǎn)介：
- 家蠶為農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，以桑樹(shù)作為唯一的食物來(lái)源。家蠶對(duì)桑葉的攝入量非常大，但對(duì)桑葉的飼料效力利用率卻只有11%左右，大部分纖維素不能利用，而提高家蠶對(duì)纖維素的利用率是傳統(tǒng)雜交育種方法不能解決的，只有靠外源基因?qū)氩趴赡艿玫浇鉀Q。桑園害蟲(chóng)桑天牛（Apripona germari ）能大量破壞桑樹(shù)，它能有效地利用桑園木質(zhì)部作為食物而維系自身的生存，既然桑天牛能以桑樹(shù)樹(shù)干作為食物，說(shuō)明它體內(nèi)具有消化纖維素的酶體系，經(jīng)酶活力檢測(cè)表明其對(duì)纖維素有很強(qiáng)的消化能力。將獲得的桑天牛纖維素酶基因AgEGaseI運(yùn)用PiggyBac轉(zhuǎn)基因載體技術(shù)通過(guò)顯微注射導(dǎo)入家蠶蠶卵基因組中，將獲得的轉(zhuǎn)基因蠶卵進(jìn)一步培養(yǎng)篩選，獲得了在基因組中含有桑天牛纖維素酶基因，通過(guò)培養(yǎng)篩選，在腸道中能夠有所表達(dá)的家蠶個(gè)體，通過(guò)基因組PCR，Nothern Blot分析，以及對(duì)家蠶組織提取液的酶活鑒定，最終確定獲得了能表達(dá)桑天牛纖維素酶AgGEaseI的轉(zhuǎn)基因家蠶。
- 詳細(xì)介紹：
- 目前我國(guó)土地資源很緊張，桑院和農(nóng)作物有土地競(jìng)爭(zhēng)矛盾。高效農(nóng)業(yè)發(fā)展仍然是我國(guó)戰(zhàn)略舉措。因此，本研究目的就是利用較成熟的轉(zhuǎn)基因等生物工程技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)育種方法，將外源性纖維素酶導(dǎo)入家蠶基因組，進(jìn)而產(chǎn)生可表達(dá)外源纖維素酶并可穩(wěn)定傳代的家蠶新品種。這樣就可以大大提高土地利用率，為蠶農(nóng)節(jié)約和創(chuàng)收作出貢獻(xiàn)。 家蠶(學(xué)名：Bombyx mori)是蠶蛾的幼蟲(chóng)，絲綢原料的主要來(lái)源，在人類(lèi)經(jīng)濟(jì)生活及文化歷史上有重要地位。家蠶是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)之一，為寡食性昆蟲(chóng)，主要以桑葉為食物源，但家蠶對(duì)桑葉中含有的纖維素幾乎不能被利用。纖維素作為植物細(xì)胞壁組成成分之一，占植物干重的35%～50%，是地球上分布最廣、含量最豐富的碳水化合物。但由于天然纖維素呈結(jié)晶狀、不溶性的剛性結(jié)構(gòu)，一般不能被直接消化吸收。家蠶對(duì)桑葉的攝入量非常大，但對(duì)桑葉的飼料效力利用率卻只有11%左右，大部分纖維素不能利用，這是至今困擾養(yǎng)蠶業(yè)的難題之一，也是如何緩解桑園土地壓力的難題之一。而提高家蠶對(duì)纖維素的利用率是傳統(tǒng)雜交育種方法不能解決的，只有靠外源基因?qū)氩趴赡艿玫浇鉀Q。 纖維素酶（cellulase）是一種多組分酶系, 包括葡聚糖內(nèi)切酶( Endoglucanase, EG) 、葡聚糖外切酶( cellobiohydrolase, CBH) 和β- 葡萄糖苷酶( β- glucosidase, 也稱(chēng)CB 酶或纖維二糖酶)，能水解纖維素β-1，4葡萄糖苷鍵，使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖，進(jìn)而能被生物體直接利用。纖維素酶來(lái)源非常廣泛，自然界中多種生物均能產(chǎn)生纖維素酶，利用纖維素作為能量來(lái)源。最早在一些食木性節(jié)肢昆蟲(chóng)如食木蟑螂，白蟻等腸液中，人們已在其腸液中檢測(cè)到纖維素酶的活性。隨后, 對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)、貽貝、鮑魚(yú)、甲蟲(chóng)、福壽螺等體內(nèi)纖維素酶基因進(jìn)行克隆, 進(jìn)一步證實(shí)了內(nèi)源性動(dòng)物纖維素酶的存在。昆蟲(chóng)腸液中的纖維素酶具有高效的纖維素降解活性?？捎衫ハx(chóng)自身合成，或由腸液中的共生生物合成，或兩者共同合成。 桑天牛（Apripona germari ）屬鞘翅目，天?？疲俏：ι?shù)的重要害蟲(chóng)之一。桑天牛幼蟲(chóng)主要位于桑樹(shù)枝干的皮下和木質(zhì)部份，以蛀食樹(shù)干木質(zhì)成份為生，其活動(dòng)削弱樹(shù)勢(shì)，重者可造成樹(shù)木枯死。研究發(fā)現(xiàn)，桑天牛幼蟲(chóng)的腸液內(nèi)有著完整的纖維素酶體系，包括β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶Ⅰ（Ag-EGase I），β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ（Ag-EGaseⅡ），β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶Ⅲ（Ag-EGase Ⅲ）。 轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展至今已經(jīng)成功的在多個(gè)物種上實(shí)現(xiàn)了定向改良。繼轉(zhuǎn)基因技術(shù)在果蠅、蚊子等昆蟲(chóng)中已獲得成功后，該技術(shù)也已在家蠶中成功使用。目前家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)也已日臻成熟，它不僅可用于功能基因的研究，甚至還是實(shí)現(xiàn)利用家蠶合成有用蛋白質(zhì)、開(kāi)發(fā)家蠶生物反應(yīng)器，成為利用功能基因開(kāi)發(fā)新的蠶品種的關(guān)鍵技術(shù)。作為昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)中重要的一環(huán)hermes, hobo, mariner, minos 以及 piggyBac等轉(zhuǎn)座子相繼被用于家蠶轉(zhuǎn)基因研究。其中piggyBac因可較完整地整合到家蠶基因組中，目前是比較常用的家蠶轉(zhuǎn)基因載體。而用于陽(yáng)性個(gè)體篩選的依據(jù)則是根據(jù)載體上連接的熒光蛋白基因的表達(dá)。 通過(guò)生物信息學(xué)分析和PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，我們從獲得了桑天牛中腸中獲得了纖維素酶AgEGaseI的開(kāi)放閱讀框（ORF）的全長(zhǎng)cDNA序列，對(duì)其特性及產(chǎn)物特性進(jìn)行了分析比對(duì)，并根據(jù)獲得的基因序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR手段獲得了桑天牛纖維素酶AgEGaseI的基因序列。將其進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示獲得的桑天牛纖維素酶基因AgEGaseI開(kāi)放閱讀框（ORF）與GeneBank中所公布的序列一致，確定了所獲得的纖維素酶基因片段的正確性。對(duì)其進(jìn)行原核與真核表達(dá)并通過(guò)資料的檢索，確定了其酶活以及其表達(dá)的可能性，最終將獲得的AgEGaseI基因片段連入轉(zhuǎn)基因載體pBac[3×P3-EGFPafm] plasmid上，利用電轉(zhuǎn)化和穿刺接種法，將該轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入家蠶秋風(fēng)品系產(chǎn)卵4小時(shí)內(nèi)的受精卵內(nèi)，將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)基因操作后的蠶卵在25℃且培養(yǎng)環(huán)境濕度達(dá)到飽和狀態(tài)的無(wú)菌環(huán)境中培養(yǎng)。通過(guò)對(duì)G0-G1代家蠶的幼蠶進(jìn)行體外的觀測(cè)，并取所獲得的幼蠶基因組進(jìn)行PCR鑒定，相比較之未進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作的家蠶，在PCR結(jié)果和體外熒光檢測(cè)過(guò)程中均證實(shí)了獲得了基因組中含有目的基因AgEGaseI的轉(zhuǎn)基因家蠶。為了進(jìn)一步檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的成功與否，將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)基因操作的家蠶與未進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作的家蠶作為對(duì)照，提取其中腸組織進(jìn)行低溫研磨，提取其勻漿液離心去除雜質(zhì)后，滴加在含有羧甲基纖維素鈉（CMC）為底物的平板上，根據(jù)是否形成空斑對(duì)其是否含有纖維素酶活性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示在經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)基因操作的家蠶腸道內(nèi)，表現(xiàn)出微弱的纖維素酶活性。至此，本次實(shí)驗(yàn)已達(dá)到了預(yù)期的目的，在經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)基因操作后，獲得了含有桑天牛纖維素酶基因，并能夠進(jìn)行表達(dá)的家蠶。通過(guò)接下來(lái)的篩選和回交，預(yù)期將獲得能夠大量表達(dá)纖維素酶活性，并對(duì)桑葉纖維素更有效利用的家蠶新品種。 本實(shí)驗(yàn)利用先進(jìn)的轉(zhuǎn)基因手段，巧妙地將外源纖維素酶基因轉(zhuǎn)入對(duì)家蠶品系進(jìn)行定向的改良，并獲得了成功。本實(shí)驗(yàn)的成功表示明著轉(zhuǎn)基因技術(shù)在家蠶養(yǎng)殖品種的定向培育和種質(zhì)改良方面有著巨大的潛力，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的符合人們?cè)竿霓D(zhuǎn)基因生物已經(jīng)成為可能。同時(shí)也為纖維素酶基因在其它物種上有效利用提供非常好的借鑒作用此次實(shí)驗(yàn)的實(shí)際意義在于利用可表達(dá)纖維素酶的家蠶品系來(lái)緩解如今土地資源緊張的與蠶桑養(yǎng)殖業(yè)對(duì)桑葉的需求量日益加大之間的矛盾，為以后開(kāi)發(fā)節(jié)能高效性蠶桑養(yǎng)殖提供了思路。
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作品專(zhuān)業(yè)信息
撰寫(xiě)目的和基本思路
- 家蠶是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)之一，為寡食性昆蟲(chóng)，主要以桑葉為食物源，家蠶對(duì)桑葉的攝入量非常大，但對(duì)桑葉的飼料效力利用率卻只有11%左右，大部分纖維素不能利用。提高家蠶對(duì)纖維素的利用率是傳統(tǒng)雜交育種方法不能解決的，只有靠外源基因?qū)氩趴赡艿玫浇鉀Q。因此，本研究的目的就是利用較成熟的轉(zhuǎn)基因等生物工程技術(shù)，將外源性纖維素酶導(dǎo)入家蠶基因組，進(jìn)而產(chǎn)生可表達(dá)外源纖維素酶并可穩(wěn)定傳代的家蠶新品種。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 科學(xué)性：利用較成熟的轉(zhuǎn)基因生物工程技術(shù)，將外源性纖維素酶導(dǎo)入家蠶基因組，進(jìn)而產(chǎn)生可表達(dá)外源纖維素酶并可穩(wěn)定傳代的家蠶新品種。 先進(jìn)性及獨(dú)特之處：家蠶與桑天牛在分類(lèi)學(xué)上雖為不同目，但同為以桑樹(shù)為生存的昆蟲(chóng)。因此，設(shè)想將桑天牛纖維素酶基因轉(zhuǎn)移到家蠶體內(nèi)會(huì)有很好的適應(yīng)性,該思路是科學(xué)的。目前全世界養(yǎng)蠶科學(xué)家未開(kāi)展本研究或沒(méi)這樣構(gòu)想，本研究采用的轉(zhuǎn)基因方法也是先進(jìn)的，研究?jī)?nèi)容是獨(dú)特的。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 目前我國(guó)土地資源很緊張，桑園和農(nóng)作物有土地競(jìng)爭(zhēng)矛盾。高效農(nóng)業(yè)發(fā)展仍然是我國(guó)戰(zhàn)略舉措。因此，本研究目的就是利用較成熟的轉(zhuǎn)基因等生物工程技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)育種方法，將外源性纖維素酶導(dǎo)入家蠶基因組，進(jìn)而產(chǎn)生可表達(dá)外源纖維素酶并可穩(wěn)定傳代的家蠶新品種。這樣就可以大大提高土地利用率，為蠶農(nóng)節(jié)約和創(chuàng)收作出貢獻(xiàn)。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 在桑天牛中腸中獲得了纖維素酶AgEGaseI的開(kāi)放閱讀框的全長(zhǎng)cDNA序列，對(duì)其特性產(chǎn)物特性進(jìn)行分析比對(duì)，并根據(jù)獲得的基因序列設(shè)計(jì)引物。提取桑天牛幼蟲(chóng)基因組cDNA為模板，對(duì)AgEGaseI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。獲得了和預(yù)測(cè)大小一致的條帶，進(jìn)行回收后連接T載體進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果和預(yù)期相符。設(shè)計(jì)真核引物并以T載體為模板，將將擴(kuò)增片段該基因連接到HTb載體，轉(zhuǎn)化含AcBacmid的DH10，藍(lán)白斑篩選后將正確轉(zhuǎn)座的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞進(jìn)行真核表達(dá)，經(jīng)過(guò)產(chǎn)物分析和酶活檢測(cè)確定了在真核Sf9細(xì)胞中表達(dá)出了含β-1，4-糖苷內(nèi)切酶水解活性的纖維素酶。采用本實(shí)驗(yàn)室培育的家蠶為轉(zhuǎn)基因?qū)ο?，?duì)剛產(chǎn)下的家蠶卵進(jìn)行轉(zhuǎn)基因顯微注射，通過(guò)熒光標(biāo)記篩選鑒定，成功地獲得了導(dǎo)入帶有纖維素酶外源基因的家蠶個(gè)體，對(duì)含有外源基因家蠶個(gè)體進(jìn)行組織酶活鑒定，在其中腸內(nèi)能檢測(cè)到了纖維素酶活性，最終成功獲得了表達(dá)纖維素酶的轉(zhuǎn)基因家蠶。
獲獎(jiǎng)情況
- 1.作者，利用電穿孔法構(gòu)建含桑天牛纖維素酶基因的轉(zhuǎn)基因家蠶《江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)》 錄用 2.作者，一種新的家蠶信息素相關(guān)蛋白基因BmP218的生物信息學(xué)分析及功能預(yù)測(cè)《生物技術(shù)通訊》 錄用 3.導(dǎo)師，作者，Isolation and characterization of a partial pumilio gene with complete PUF-domain in silkworm Bombyx mori African.Entomology SCI收錄 4.導(dǎo)師，作者，A genome-wide survey on basic helix-loop-helix transcription factors in rat and mouse SCI收錄 5.導(dǎo)師，作者Phylogenetic Analysis of Zebrafish Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors SCI收錄 6.專(zhuān)利：基于piggyBac創(chuàng)建可利用桑葉纖維素的轉(zhuǎn)基因家蠶 提交
鑒定結(jié)果
參考文獻(xiàn)
- 1.Prabavathy V.R, Mathjvanan N, Sagadevan E. Intrn-strain protoplast fusion enhances carbaxymethyl cellulose activity in Trichoderma reesei. Enzyme and Microbial Technology 2.Hideo Toyama, Naotsugu Yamagishi, Nobuo Toyama, Construction of cellulose hyper-producers of Trichoderma reesei Rut C-30 for utilization of waste paper using colchicina and benotnyl [J]. Journal of Moleular Catalysis B: Enzymic 3.Adsul M.G, Bastawde, K.B, Varma A.J,et al.Strain improvement of Penicillium janthinelum NCIM 1171 for increased cellulose production. Bionesource Technology 4.Rlaan Den Haan, Shaunjta H Rose, Lee R Lynd, et al. Hydrolysis and fermentation of amcrphous cellulase by recombinant Saccharomyces cerevisice. Metabobic engineering. 5.Watanabe, H., Noda, H., Tokuda, G. A cellulase gene of termite origin. Nature 6.Lee S J, Kim S R, Yoon H J, et al. cDNA cloning,expression, and en zymatic activity of a cellulase from the mulberry longicorn beetle, apriona germari [J]. Biochem Mol Biol
同類(lèi)課題研究水平概述
- 纖維素占植物干重的35%～50%，是地球上分布最廣、含量最豐富的碳水化合物，但不能被直接利用吸收。纖維素酶（cellulase）是一種多組分酶系，使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖，進(jìn)而能被生物體利用。迄今已從三種甲蟲(chóng)體內(nèi)分離出內(nèi)生性纖維素酶，桑天牛屬于其中一種。桑天牛（Apripona germari）屬鞘翅目，天牛科，是危害桑樹(shù)的重要害蟲(chóng)之一。桑天牛幼蟲(chóng)主要位于桑樹(shù)枝干的皮下和木質(zhì)部份，以蛀食樹(shù)干木質(zhì)成份為生，其活動(dòng)削弱樹(shù)勢(shì)，重者可造成樹(shù)木枯死。研究發(fā)現(xiàn)，桑天牛幼蟲(chóng)的腸液內(nèi)有著完整的纖維素酶體系，其中Ag-EGaseⅢ在55℃和pH值6的環(huán)境中活性最高，在60℃時(shí)該酶可保持穩(wěn)定10分鐘，這與另兩種酶非常相似。從熱穩(wěn)定上，Ag-EGaseⅢ與Ag-EGaseⅡ相似。而從酶活性上，Ag-EGaseⅢ與Ag-EGaseI相似。雖然從酶特性上三種纖維素酶存在一定的差異，但根據(jù)種系發(fā)生關(guān)系及蛋白結(jié)構(gòu)又可同歸于糖基水解酶45家族。三種纖維素酶主要表達(dá)于前腸和中腸，通過(guò)協(xié)同作用共同水解纖維素。 繼轉(zhuǎn)基因技術(shù)在果蠅、蚊子等昆蟲(chóng)中已獲得成功后，該技術(shù)也已在家蠶中成功使用。目前家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)也已日臻成熟，它不僅可用于功能基因的研究，甚至還是實(shí)現(xiàn)利用家蠶合成有用蛋白質(zhì)、開(kāi)發(fā)家蠶生物反應(yīng)器，成為利用功能基因開(kāi)發(fā)新的蠶品種的關(guān)鍵技術(shù)hermes, hobo, mariner, minos 以及piggyBac等轉(zhuǎn)座子相繼被用于家蠶轉(zhuǎn)基因研究。其中piggyBac因可較完整地整合到家蠶基因組中，目前是比較常用的家蠶轉(zhuǎn)基因載體。載體的篩選標(biāo)記是檢測(cè)轉(zhuǎn)座成功與否的重要方面，人工啟動(dòng)子3×P3可啟動(dòng)子EGFP或DsRed等熒光蛋白在家蠶視細(xì)胞表達(dá)，方便了轉(zhuǎn)基因家蠶的篩選工作。目前應(yīng)用于家蠶的轉(zhuǎn)基因方法有顯微注射法、基因槍法、電穿孔法、脂質(zhì)體法、精子介導(dǎo)法、壓力滲透法、扎卵法等。我們實(shí)驗(yàn)室從2005年開(kāi)始建立家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系，目前比較成熟的方法主要是顯微注射和基因槍法。 綜上所述，桑天牛幼蟲(chóng)寄生于桑樹(shù)枝干，生活習(xí)性與家蠶幼蟲(chóng)的類(lèi)似，其纖維素酶組分合理，酶活性非常適合桑葉纖維素的分解。對(duì)于桑天牛纖維素酶的應(yīng)用，特別是通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法將導(dǎo)入家蠶基因組的研究，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)類(lèi)似報(bào)道。本研究成果的應(yīng)用對(duì)于提高桑園土地利用率和桑葉的利用率，增強(qiáng)我國(guó)絲綢產(chǎn)業(yè)國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力方面將具有重要的意義。
