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基本信息
- 項(xiàng)目名稱(chēng)：
- 白菜、甘藍(lán)中決定花色等重要性狀的F3'H基因的克隆與分析
- 來(lái)源：
- 第十一屆“挑戰(zhàn)杯”國(guó)賽作品
- 小類(lèi)：
- 生命科學(xué)
- 大類(lèi)：
- 自然科學(xué)類(lèi)學(xué)術(shù)論文
- 簡(jiǎn)介：
- 本研究首次克隆了白菜和甘藍(lán)這兩個(gè)蕓薹屬重要物種的F3'H基因的全長(zhǎng)cDNA和基因組序列，對(duì)其基因和編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，表明它們屬于典型的F3'H基因，也發(fā)現(xiàn)了一些重要的分子生物學(xué)現(xiàn)象，如可變性轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和加尾位點(diǎn)。對(duì)白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜、擬南芥的F3'H基因進(jìn)行了屬內(nèi)和屬間比較基因組學(xué)分析，表明白菜和甘藍(lán)的確是甘藍(lán)型油菜的基因供體，蕓薹屬祖先中F3'H三倍化加倍后可能發(fā)生了基因丟失象。因此，本研究有利于闡明白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜這3個(gè)物種的類(lèi)黃酮性狀如觀賞花色、異花授粉、莖葉著色、種皮色澤、食用器官中類(lèi)黃酮保健成分含量等的分子機(jī)理，也通過(guò)轉(zhuǎn)基因和功能基因分子標(biāo)記輔助育種改良這些性狀提供了目標(biāo)基因。
- 詳細(xì)介紹：
- 研究背景：類(lèi)黃酮3'羥化酶(F3'H)是類(lèi)黃酮物質(zhì)生物合成的關(guān)鍵酶，參與決定花色、種皮色澤、莖葉表面花青素苷著色等重要性狀; 研究?jī)?nèi)容：分別克隆白菜和甘藍(lán)的全長(zhǎng)F3'H基因，預(yù)測(cè)基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征、潛在功能和比較基因組學(xué)特征; 主要結(jié)果：所克隆的白菜F3'H（BrF3'H）和甘藍(lán)F3'H（BoF3'H）的全長(zhǎng)基因分別為3067bp和3128bp，都有3個(gè)GT/AG型內(nèi)含子，前導(dǎo)序列富含C而缺乏G且包含一個(gè)Kozak序列，3'UTR有多處poly(A)加尾信號(hào)。BrF3'H和BoF3'H的全長(zhǎng)cDNA分別為1871bp和1874bp，ORF均為1536bp，編碼511個(gè)氨基酸，蛋白分子量均為56.6kD，等電點(diǎn)均為7.1。預(yù)測(cè)BrF3'H和BoF3'H是典型的細(xì)胞色素P450蛋白，均有信號(hào)肽，有2個(gè)跨膜域，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，并存在磷酸化修飾，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和隨機(jī)卷曲組成。系統(tǒng)發(fā)生分析和多重比對(duì)表明，BrF3'H和BoF3'H是擬南芥和甘藍(lán)油菜F3'H的垂直同源基因。電子克隆分別顯示了白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜的1、1、2條F3'H基因，暗示蕓薹屬祖先中F3'H三倍化加倍后可能發(fā)生了基因丟失現(xiàn)象。
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作品專(zhuān)業(yè)信息
撰寫(xiě)目的和基本思路
- 基本思路：設(shè)計(jì)白菜、甘藍(lán)全長(zhǎng)基因擴(kuò)增引物；提取總RNA和總DNA，反轉(zhuǎn)錄獲得總cDNA第一鏈；PCR擴(kuò)增F3'H基因的全長(zhǎng)cDNA和DNA，瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收，連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測(cè)序；對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 目的：通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)該基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征、潛在功能和基因進(jìn)化特點(diǎn)，對(duì)白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜、擬南芥的F3'H基因進(jìn)行屬內(nèi)和屬間比較基因組學(xué)分析。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 科學(xué)性：(1)首次克隆了白菜、甘藍(lán)的全長(zhǎng)F3'H基因(2)揭示了蕓薹屬F3'H的進(jìn)化和比較基因組學(xué)特點(diǎn)(3)有助于闡明蕓薹屬植物類(lèi)黃酮性狀的分子機(jī)理和推動(dòng)分子育種。 先進(jìn)性：在研究手段和研究方案的制定和論文寫(xiě)作中，綜合采用了分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、生物信息學(xué)、比較基因組學(xué)、分子進(jìn)化等學(xué)科的新理論和新方法。 獨(dú)特性：利用了電子克隆這一新技術(shù)輔助引物設(shè)計(jì)。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 現(xiàn)實(shí)意義：本研究有利于闡明白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜的花色、種皮色澤、類(lèi)黃酮保健成分等的分子機(jī)理，為分子育種提供目標(biāo)基因。 實(shí)際應(yīng)用價(jià)值：蕓薹屬白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜是重要蔬菜、油料或觀賞作物，也是作物進(jìn)化和比較基因組學(xué)研究熱點(diǎn)。類(lèi)黃酮是植物界的重要次生物質(zhì)，影響多種性狀。而決定花色等性狀的類(lèi)黃酮的產(chǎn)生均需類(lèi)黃酮3'-羥化酶/F3'H的參與，F(xiàn)3'H對(duì)蕓薹屬具有重要的生物學(xué)功能和作物學(xué)價(jià)值。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 類(lèi)黃酮3'-羥化酶(F3’H)參與決定花色、種皮色素和莖葉著色等性狀。本研究克隆了3067bp的白菜 F3’H(BrF3'H)和3128bp的甘藍(lán)F3’H (BoF3’H)全長(zhǎng)基因，它們都有3個(gè)內(nèi)含子，前導(dǎo)序列有典型Kozak結(jié)構(gòu)，5'UTR富含C而缺乏G，3'UTR有多處可能的poly(A)加尾信號(hào)。BrF3’H全長(zhǎng)cDNA1871bp，編碼511個(gè)氨基酸，蛋白分子量56.64kD，等電點(diǎn)7.10。BoF3’H全長(zhǎng)cDNA1874bp，編碼511個(gè)氨基酸，蛋白分子量56.57kD，等電點(diǎn)7.08。預(yù)測(cè)BrF3’H和BoF3’H是典型的細(xì)胞色素P450，具有F3'H的所有特征基序，均有一個(gè)信號(hào)肽和至少2個(gè)跨膜域，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，可能存在磷酸化修飾，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋和隨機(jī)卷曲，α-螺旋主要位于蛋白的中部。BrF3’H和BoF3’H與甘藍(lán)型油菜和擬南芥的F3’H高度同源，互為垂直同源基因，與其它F3’H基因也廣泛同源。GenBank序列標(biāo)簽和本研究均顯示白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜分別僅有1、1、2個(gè)F3’H基因，暗示在蕓薹族祖先中F3’H三倍化后可能發(fā)生了部分水平同源基因的丟失。
獲獎(jiǎng)情況
- 2009年6月，第十一屆“挑戰(zhàn)杯”全國(guó)大學(xué)生學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽重慶賽區(qū)一等獎(jiǎng)
鑒定結(jié)果
- 2009年6月15日教育部科技查新工作站查新結(jié)論：在國(guó)內(nèi)外檢出文獻(xiàn)中，未見(jiàn)如委托查新項(xiàng)目白菜、甘藍(lán)中決定花色等重要性狀的F3’H基因的克隆與分析一樣的相關(guān)研究報(bào)道，也未見(jiàn)相關(guān)專(zhuān)利申請(qǐng)。
參考文獻(xiàn)
- Johnston JS, Pepper AE, Hall AE, et al. (2005) Evolution of genome size in Brassicaceae. Ann Bot, 95: 229–235. Xu B-B, Lia J-N, Zhang X-K, et al. (2007) Cloning and molecular characterization of a functional flavonoid 3'-hydroxylase gene from Brassica napus. J plant physiol, 164: 350–363.
同類(lèi)課題研究水平概述
- 白菜(B. rapa)包含重要的油料和蔬菜作物，甘藍(lán)(B. oleracea)包含了重要的蔬菜和觀賞作物，由白菜和甘藍(lán)天然雜交加倍而成的異源四倍體物種甘藍(lán)型油菜(B. napus)是世界上重要的油料作物，它們均具有重要的經(jīng)濟(jì)和理論研究?jī)r(jià)值。 類(lèi)黃酮是廣泛存在于植物界的重要次生物質(zhì)，影響多種性狀。蕓薹屬花瓣和花粉的色素主要為黃酮醇，與吸引昆蟲(chóng)異花授粉、繁殖種子緊密相關(guān)，也賦予了花的觀賞價(jià)值；黃酮醇等還是白菜、甘藍(lán)等蔬菜的保健成分，在人體內(nèi)能清除自由基和增加抗氧化性；紫菜苔、羽衣甘藍(lán)的觀賞性色素是花青素苷，它也是天然色素，在人體內(nèi)也具有抗氧化活性；原花青素是種皮色素的主要成分，降低種皮色素可以減少菜籽油的色素污染，提高餅粕的飼用價(jià)值。上述各種類(lèi)黃酮物質(zhì)的生物合成均需要黃酮3'-羥化酶（F3'H）的參與，F(xiàn)3'H對(duì)于蕓薹屬具有重要的生物學(xué)功能和作物學(xué)價(jià)值。 F3'H基因已在多種植物中被克隆。擬南芥中，F(xiàn)3'H的突變導(dǎo)致種皮顏色由野生型的深褐色改變?yōu)樯n白色，稱(chēng)為透明種皮7(transparent testa 7, tt7)位點(diǎn)。大豆中，F(xiàn)3'H的突變影響種皮和表皮毛中的色素成分。通過(guò)F3'H轉(zhuǎn)基因改變花色方面也取得了初步效果。 白菜和甘藍(lán)F3'H基因尚未被克隆?？v觀國(guó)內(nèi)外，整個(gè)蕓薹屬植物的異花授粉、觀賞花色、莖葉著色、種皮色澤、食用器官的類(lèi)黃酮保健成分等性狀的分子機(jī)理研究方興未艾，相應(yīng)的分子育種幾乎還是空白。本課題組已完成了甘藍(lán)型油菜BnF3'H-1等基因的全長(zhǎng)克隆。研究F3'H有助于闡明白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜上述性狀形成的分子機(jī)理，為這些性狀的分子育種奠定基礎(chǔ)。 近年來(lái)大量的比較基因組研究表明，蕓薹族祖先中發(fā)生了基因組的三倍化，蕓薹屬二倍體基本種和四倍體復(fù)合種中應(yīng)當(dāng)分別約有3條和6條垂直同源基因與擬南芥的每條功能基因相對(duì)應(yīng)。本課題組此前的研究表明甘藍(lán)型油菜中可能只有2條左右的F3'H基因，這與三倍化假說(shuō)相矛盾，因此克隆白菜和甘藍(lán)的F3'H也有助于闡明蕓薹屬F3'H的進(jìn)化和比較基因組學(xué)特點(diǎn)。 本研究以白菜的白菜型油菜亞種(ssp. oleifera)、甘藍(lán)的羽衣甘藍(lán)亞種(ssp. acephala)為材料，在電子克隆輔助引物設(shè)計(jì)下，分別克隆了一條全長(zhǎng)F3'H基因，并對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)的序列分析和初步的比較基因組學(xué)分析。國(guó)際國(guó)內(nèi)沒(méi)有與本文內(nèi)容相似的研究報(bào)道。
