基本信息
- 項目名稱：
- EBI3蛋白基因克隆、表達、多克隆抗體制備及其鑒定
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術論文
- 簡介：
- 本研究采用分子生物學方法原核表達重組鼠EBI3（Epstein-Barr virus-induced gene3）蛋白，Western blot對其鑒定，用重組蛋白免疫小鼠制備并純化得到抗重組鼠EBI3蛋白多克隆抗體，ELISA檢測其免疫反應性。為進一步研究EBI3蛋白在病原生物感染宿主中功能的研究奠定了基礎。
- 詳細介紹：
- EB病毒誘導基因3（Epstein-Barr virus-induced gene3,EBI3）蛋白最先是在B淋巴細胞受EB病毒感染后的表達產物中發(fā)現的，與IL-12-p40亞基和睫狀神經營養(yǎng)因子受體（ciliary neurotrophic factor receptor，CNTFR)同源，屬于造血因子受體家族。 EBI3蛋白的已知存在形式有三種：與p28組成異二聚體IL-27，與p35組成異二聚體IL-35和同二聚體。在人類淋巴組織中，EBI3蛋白已經在扁桃體、脾臟中被發(fā)現以及在正常妊娠足月胎盤中高表達，EBI3蛋白在霍奇金淋巴瘤里同樣高度表達。 最近有大量研究聚焦在IL-27對T細胞的調節(jié)上。IL-27通過激活初始CD4+ T 細胞的Jak/STAT通路來誘導T-bet和IL-12受體β2鏈的表達，協同IL-12刺激初始CD4+ T 細胞向Th1方向化;Toxoplasma gondii感染小鼠模型中IL-27又可以抑制過度的Th1反應;最近還證實了IL-27對Th17細胞有抑制作用。Liew等人發(fā)現IL-35可以抑制Th17細胞的分化,同二聚體的功能尚不清楚。Th17細胞是最近被確定為不同于Th1細胞和Th2細胞的CD4+ T細胞的一個新的亞群，通過分泌IL-17， IL-21，IL-22等炎癥因子，在宿主防御反應和自身免疫性疾病中具有重要的調節(jié)作用。 EBI3蛋白的存在形式和表達部位都顯示EBI3蛋白在免疫系統(tǒng)中具有重要功能。為此， 本研究采用分子生物學方法原核表達重組鼠EBI3蛋白，Western blot對其鑒定，用重組蛋白免疫小鼠制備并純化得到到抗重組鼠EBI3蛋白IgG抗體，ELISA檢測其免疫反應性。為進一步研究EBI3蛋白在病原生物感染宿主中功能的研究奠定了基礎。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 本研究采用分子生物學方法原核表達重組鼠EBI3（Epstein-Barr virus-induced gene3）蛋白，Western blot對其鑒定，用重組蛋白免疫小鼠制備并純化得到抗重組鼠EBI3蛋白多克隆抗體，ELISA檢測其免疫反應性。為進一步研究EBI3蛋白在病原生物感染宿主中功能的研究奠定了基礎。
科學性、先進性及獨特之處
- 經查文獻，未發(fā)現關于原核表達重組鼠EBI3蛋白和制備抗重組鼠EBI3蛋白多克隆抗體的報道，IL-27與IL-35對Th17細胞均有負調控作用，EBI3蛋白作為IL-27與IL-35的共同亞基，所以對EBI3蛋白的研究無疑為進一步探討EBI3蛋白的功能及其對Th-17細胞的調控作用奠定了理論和實驗基礎。
應用價值和現實意義
- 國外在研究EBI3蛋白在病原生物感染宿主中的功能時，幾乎用的都是EBI3或WSX-1（IL-27受體的亞基之一）基因敲除小鼠，而國內對EBI3蛋白的研究鮮有報道。大量研究聚焦在IL-27對IL-17的負調控上，而抗重組鼠EBI3蛋白多克隆抗體與重組鼠EBI3蛋白均有可能作用于小鼠IL-27/IL-35與其受體，從而影響IL-27/IL-35的功能，進而影響到IL-17的分泌。
學術論文摘要
- 目的 構建鼠EB病毒誘導基因3（Epstein-Barr virus-induced gene3,EBI3）的原核表達質粒,體外表達純化后制備多克隆抗體。方法 收集日本血吸蟲感染的C57BL/6小鼠脾細胞后提取總RNA,利用所合成引物經RT-PCR獲得EBI3的cDNA，將該基因亞克隆入原核表達載體pET32a(+),轉化至大腸埃希菌(E.coli)BL21株,經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達，對包涵體進行變性、純化和復性后獲得可溶性的重組鼠EBI3蛋白，Western blot對其鑒定。用純化的重組蛋白免疫BALB/c小鼠獲取血清，經飽和硫酸銨法和DEAE-Sephadex A-50柱純化得到抗重組鼠EBI3蛋白多克隆抗體，ELISA檢測其免疫反應性。結果及結論 基因工程獲得目的蛋白復性成功后經Western blot鑒定證實為重組鼠EBI3蛋白，免疫小鼠后取血清，分離純化獲得抗重組鼠EBI3蛋白多克隆抗體，ELISA結果表明該蛋白具有一定的免疫反應性。為進一步研究EBI3蛋白在病原生物感染宿主中功能的研究奠定了基礎。
獲獎情況
- 第三屆“挑戰(zhàn)杯”合鍛集團安徽省大學生課外學術科技作品競賽 一等獎
鑒定結果
- 無
參考文獻
- [1] Pflanz S, Timans JC, Cheung J, et al. IL-27, a heterodimeric cytokine composed of EBI3 and p28 protein, induces proliferation of naive CD4(+) T cells. Immunity, 2002; 16:779-790. [2] Christopher A, Alejandro V, David A, et al. The role of IL-27 in the development of T-cell responses during parasitic infections. Immunological Reviews, 2004; 202:106-114. [3] John C, Paul R. All in the family: IL-27 suppression of TH-17 cells. Nature Immunology, 2006; 7:899-902. [4] Niedbala W, Wei X, Cai B, et al. IL-35 is a novel cytokine with therapeutic effects against collagen-induced arthritis through the expansion of regulatory T cells and suppression of Th17 cells. Eur J Immunol, 2007; 37:3021-3029. [5] 張玉俠. 效應分子IL-17的抗感染作用. 國際免疫學雜志, 2009; 32(3):241-244. [6] Jianfei Yang, Min Yang, Tin Min Htut, et al. Epstein-Barr virus-induced gene 3 negatively regulates IL-17, IL-22 and RORγt. Eur J Immunol, 2008; 38:1204-1214.
同類課題研究水平概述
- EBI3蛋白最先是在B淋巴細胞受EB病毒感染后的表達產物中發(fā)現的，與IL-12-p40亞基和睫狀神經營養(yǎng)因子受體（ciliary neurotrophic factor receptor，CNTFR)同源，屬于造血因子受體家族。 EBI3蛋白的已知存在形式有三種：與p28組成異二聚體IL-27，與p35組成異二聚體IL-35和同二聚體。在人類淋巴組織中，EBI3蛋白已經在扁桃體、脾臟中被發(fā)現以及在正常妊娠足月胎盤中高表達，EBI3蛋白在霍奇金淋巴瘤里同樣高度表達。 最近有大量研究聚焦在IL-27對T細胞的調節(jié)上。IL-27通過激活初始CD4+ T 細胞的Jak/STAT通路來誘導T-bet和IL-12受體β2鏈的表達，協同IL-12刺激初始CD4+T細胞向Th1方向轉化;Toxoplasma gondii感染小鼠模型中IL-27又可以抑制過度的Th1反應;而且最近也證實了IL-27對Th17細胞有抑制作用。Liew等人發(fā)現IL-35可以抑制Th17細胞的分化,同二聚體的功能尚不清楚。Th17細胞是最近被確定為不同于Th1細胞和Th2細胞的CD4+ T細胞的一個新的亞群，通過分泌IL-17， IL-21，IL-22等炎癥因子，在宿主防御反應和自身免疫性疾病中具有重要的調節(jié)作用。 國外在研究EBI3蛋白在病原生物感染宿主中的功能時，幾乎用的都是EBI3或WSX-1（IL-27受體的亞基之一）基因敲除小鼠，而國內對EBI3蛋白的研究鮮有報道。大量研究聚焦在IL-27對IL-17的負調控上，IL-17是新發(fā)現的具有強大促炎作用的細胞因子，通過誘導多種細胞（具有IL-17R的細胞）表達細胞因子和趨化因子來促進中性粒細胞的分化、遷移，一方面在自身免疫性疾病發(fā)揮重要致病作用；另一方面，IL-17還與抗感染免疫有關，在抵抗細菌及真菌的保護性免疫反映中發(fā)揮重要作用。與IL-27具有共同亞基EBI3蛋白的IL-35對IL-17也有負調控作用，Jianfei Yang等人發(fā)現用OVA（雞卵蛋白）刺激EBI3基因敲除小鼠脾細胞比刺激正常小鼠脾細胞后IL-17的分泌量明顯增高。
