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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- EBI3蛋白基因克隆、表達(dá)、多克隆抗體制備及其鑒定
- 來(lái)源：
- 第十一屆“挑戰(zhàn)杯”國(guó)賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 本研究采用分子生物學(xué)方法原核表達(dá)重組鼠EBI3（Epstein-Barr virus-induced gene3）蛋白，Western blot對(duì)其鑒定，用重組蛋白免疫小鼠制備并純化得到抗重組鼠EBI3蛋白多克隆抗體，ELISA檢測(cè)其免疫反應(yīng)性。為進(jìn)一步研究EBI3蛋白在病原生物感染宿主中功能的研究奠定了基礎(chǔ)。
- 詳細(xì)介紹：
- EB病毒誘導(dǎo)基因3（Epstein-Barr virus-induced gene3,EBI3）蛋白最先是在B淋巴細(xì)胞受EB病毒感染后的表達(dá)產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的，與IL-12-p40亞基和睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體（ciliary neurotrophic factor receptor，CNTFR)同源，屬于造血因子受體家族。 EBI3蛋白的已知存在形式有三種：與p28組成異二聚體IL-27，與p35組成異二聚體IL-35和同二聚體。在人類淋巴組織中，EBI3蛋白已經(jīng)在扁桃體、脾臟中被發(fā)現(xiàn)以及在正常妊娠足月胎盤中高表達(dá)，EBI3蛋白在霍奇金淋巴瘤里同樣高度表達(dá)。 最近有大量研究聚焦在IL-27對(duì)T細(xì)胞的調(diào)節(jié)上。IL-27通過(guò)激活初始CD4+ T 細(xì)胞的Jak/STAT通路來(lái)誘導(dǎo)T-bet和IL-12受體β2鏈的表達(dá)，協(xié)同IL-12刺激初始CD4+ T 細(xì)胞向Th1方向化;Toxoplasma gondii感染小鼠模型中IL-27又可以抑制過(guò)度的Th1反應(yīng);最近還證實(shí)了IL-27對(duì)Th17細(xì)胞有抑制作用。Liew等人發(fā)現(xiàn)IL-35可以抑制Th17細(xì)胞的分化,同二聚體的功能尚不清楚。Th17細(xì)胞是最近被確定為不同于Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的CD4+ T細(xì)胞的一個(gè)新的亞群，通過(guò)分泌IL-17， IL-21，IL-22等炎癥因子，在宿主防御反應(yīng)和自身免疫性疾病中具有重要的調(diào)節(jié)作用。 EBI3蛋白的存在形式和表達(dá)部位都顯示EBI3蛋白在免疫系統(tǒng)中具有重要功能。為此， 本研究采用分子生物學(xué)方法原核表達(dá)重組鼠EBI3蛋白，Western blot對(duì)其鑒定，用重組蛋白免疫小鼠制備并純化得到到抗重組鼠EBI3蛋白IgG抗體，ELISA檢測(cè)其免疫反應(yīng)性。為進(jìn)一步研究EBI3蛋白在病原生物感染宿主中功能的研究奠定了基礎(chǔ)。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 本研究采用分子生物學(xué)方法原核表達(dá)重組鼠EBI3（Epstein-Barr virus-induced gene3）蛋白，Western blot對(duì)其鑒定，用重組蛋白免疫小鼠制備并純化得到抗重組鼠EBI3蛋白多克隆抗體，ELISA檢測(cè)其免疫反應(yīng)性。為進(jìn)一步研究EBI3蛋白在病原生物感染宿主中功能的研究奠定了基礎(chǔ)。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 經(jīng)查文獻(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)關(guān)于原核表達(dá)重組鼠EBI3蛋白和制備抗重組鼠EBI3蛋白多克隆抗體的報(bào)道，IL-27與IL-35對(duì)Th17細(xì)胞均有負(fù)調(diào)控作用，EBI3蛋白作為IL-27與IL-35的共同亞基，所以對(duì)EBI3蛋白的研究無(wú)疑為進(jìn)一步探討EBI3蛋白的功能及其對(duì)Th-17細(xì)胞的調(diào)控作用奠定了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 國(guó)外在研究EBI3蛋白在病原生物感染宿主中的功能時(shí)，幾乎用的都是EBI3或WSX-1（IL-27受體的亞基之一）基因敲除小鼠，而國(guó)內(nèi)對(duì)EBI3蛋白的研究鮮有報(bào)道。大量研究聚焦在IL-27對(duì)IL-17的負(fù)調(diào)控上，而抗重組鼠EBI3蛋白多克隆抗體與重組鼠EBI3蛋白均有可能作用于小鼠IL-27/IL-35與其受體，從而影響IL-27/IL-35的功能，進(jìn)而影響到IL-17的分泌。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 目的 構(gòu)建鼠EB病毒誘導(dǎo)基因3（Epstein-Barr virus-induced gene3,EBI3）的原核表達(dá)質(zhì)粒,體外表達(dá)純化后制備多克隆抗體。方法 收集日本血吸蟲感染的C57BL/6小鼠脾細(xì)胞后提取總RNA,利用所合成引物經(jīng)RT-PCR獲得EBI3的cDNA，將該基因亞克隆入原核表達(dá)載體pET32a(+),轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌(E.coli)BL21株,經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)包涵體進(jìn)行變性、純化和復(fù)性后獲得可溶性的重組鼠EBI3蛋白，Western blot對(duì)其鑒定。用純化的重組蛋白免疫BALB/c小鼠獲取血清，經(jīng)飽和硫酸銨法和DEAE-Sephadex A-50柱純化得到抗重組鼠EBI3蛋白多克隆抗體，ELISA檢測(cè)其免疫反應(yīng)性。結(jié)果及結(jié)論 基因工程獲得目的蛋白復(fù)性成功后經(jīng)Western blot鑒定證實(shí)為重組鼠EBI3蛋白，免疫小鼠后取血清，分離純化獲得抗重組鼠EBI3蛋白多克隆抗體，ELISA結(jié)果表明該蛋白具有一定的免疫反應(yīng)性。為進(jìn)一步研究EBI3蛋白在病原生物感染宿主中功能的研究奠定了基礎(chǔ)。
獲獎(jiǎng)情況
- 第三屆“挑戰(zhàn)杯”合鍛集團(tuán)安徽省大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽 一等獎(jiǎng)
鑒定結(jié)果
- 無(wú)
參考文獻(xiàn)
- [1] Pflanz S, Timans JC, Cheung J, et al. IL-27, a heterodimeric cytokine composed of EBI3 and p28 protein, induces proliferation of naive CD4(+) T cells. Immunity, 2002; 16:779-790. [2] Christopher A, Alejandro V, David A, et al. The role of IL-27 in the development of T-cell responses during parasitic infections. Immunological Reviews, 2004; 202:106-114. [3] John C, Paul R. All in the family: IL-27 suppression of TH-17 cells. Nature Immunology, 2006; 7:899-902. [4] Niedbala W, Wei X, Cai B, et al. IL-35 is a novel cytokine with therapeutic effects against collagen-induced arthritis through the expansion of regulatory T cells and suppression of Th17 cells. Eur J Immunol, 2007; 37:3021-3029. [5] 張玉俠. 效應(yīng)分子IL-17的抗感染作用. 國(guó)際免疫學(xué)雜志, 2009; 32(3):241-244. [6] Jianfei Yang, Min Yang, Tin Min Htut, et al. Epstein-Barr virus-induced gene 3 negatively regulates IL-17, IL-22 and RORγt. Eur J Immunol, 2008; 38:1204-1214.
同類課題研究水平概述
- EBI3蛋白最先是在B淋巴細(xì)胞受EB病毒感染后的表達(dá)產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的，與IL-12-p40亞基和睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體（ciliary neurotrophic factor receptor，CNTFR)同源，屬于造血因子受體家族。 EBI3蛋白的已知存在形式有三種：與p28組成異二聚體IL-27，與p35組成異二聚體IL-35和同二聚體。在人類淋巴組織中，EBI3蛋白已經(jīng)在扁桃體、脾臟中被發(fā)現(xiàn)以及在正常妊娠足月胎盤中高表達(dá)，EBI3蛋白在霍奇金淋巴瘤里同樣高度表達(dá)。 最近有大量研究聚焦在IL-27對(duì)T細(xì)胞的調(diào)節(jié)上。IL-27通過(guò)激活初始CD4+ T 細(xì)胞的Jak/STAT通路來(lái)誘導(dǎo)T-bet和IL-12受體β2鏈的表達(dá)，協(xié)同IL-12刺激初始CD4+T細(xì)胞向Th1方向轉(zhuǎn)化;Toxoplasma gondii感染小鼠模型中IL-27又可以抑制過(guò)度的Th1反應(yīng);而且最近也證實(shí)了IL-27對(duì)Th17細(xì)胞有抑制作用。Liew等人發(fā)現(xiàn)IL-35可以抑制Th17細(xì)胞的分化,同二聚體的功能尚不清楚。Th17細(xì)胞是最近被確定為不同于Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的CD4+ T細(xì)胞的一個(gè)新的亞群，通過(guò)分泌IL-17， IL-21，IL-22等炎癥因子，在宿主防御反應(yīng)和自身免疫性疾病中具有重要的調(diào)節(jié)作用。 國(guó)外在研究EBI3蛋白在病原生物感染宿主中的功能時(shí)，幾乎用的都是EBI3或WSX-1（IL-27受體的亞基之一）基因敲除小鼠，而國(guó)內(nèi)對(duì)EBI3蛋白的研究鮮有報(bào)道。大量研究聚焦在IL-27對(duì)IL-17的負(fù)調(diào)控上，IL-17是新發(fā)現(xiàn)的具有強(qiáng)大促炎作用的細(xì)胞因子，通過(guò)誘導(dǎo)多種細(xì)胞（具有IL-17R的細(xì)胞）表達(dá)細(xì)胞因子和趨化因子來(lái)促進(jìn)中性粒細(xì)胞的分化、遷移，一方面在自身免疫性疾病發(fā)揮重要致病作用；另一方面，IL-17還與抗感染免疫有關(guān)，在抵抗細(xì)菌及真菌的保護(hù)性免疫反映中發(fā)揮重要作用。與IL-27具有共同亞基EBI3蛋白的IL-35對(duì)IL-17也有負(fù)調(diào)控作用，Jianfei Yang等人發(fā)現(xiàn)用OVA（雞卵蛋白）刺激EBI3基因敲除小鼠脾細(xì)胞比刺激正常小鼠脾細(xì)胞后IL-17的分泌量明顯增高。
