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基本信息
- 項目名稱：
- 基于代謝組學(xué)新方法調(diào)控新型功能因子花生四烯酸高效生物合成
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 花生四烯酸（Arachidonic acid，簡稱ARA，即5,8,11,14-二十碳四烯酸）是一種重要的長鏈多不飽和脂肪酸（PUFAs），廣泛應(yīng)用于功能保健、生物醫(yī)藥、化妝品及飼料添加劑等方面。在發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸的菌種之中，高山被孢霉（M. alpina ）被認(rèn)為是最優(yōu)良的菌種，但其屬于基因背景不清楚，代謝網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜的工業(yè)微生物，利用傳統(tǒng)的代謝工程和基因工程方法來解決此類微生物發(fā)酵問題具有一定復(fù)雜性和局限性。而新發(fā)展起來的代謝組學(xué)則能夠搭建微生物微觀信息和宏觀表型的橋梁，從而解決工業(yè)微生物發(fā)酵的關(guān)鍵問題。 本作品以實驗室篩選的三株ARA高產(chǎn)菌株M. alpina為研究對象，利用代謝組學(xué)新方法獲取在ARA生產(chǎn)過程中與產(chǎn)量和菌體生物量相關(guān)的小分子代謝物，并將其作為調(diào)控因子調(diào)控ARA的高效生物合成，使ARA在總脂肪酸中的含量由調(diào)控前的56.2% 增大到調(diào)控后的75%，ARA含量高達(dá)19.8g/l，達(dá)到國際領(lǐng)先水平。該代謝組學(xué)新方法為其它基因背景不清晰、代謝途徑復(fù)雜的工業(yè)微生物的代謝調(diào)控提供了一種簡單快速、可控高效的思路和手段。 目前，本作品中涉及的ARA生產(chǎn)與調(diào)控方法已與江蘇天凱生物科技有限公司合作，進入產(chǎn)業(yè)化中試階段，該技術(shù)方法增強了與國外ARA生產(chǎn)技術(shù)的競爭力，為擺脫國內(nèi)奶制品和制藥等行業(yè)對國外高品質(zhì)ARA供應(yīng)商的依賴具有重要意義。
- 詳細(xì)介紹：
- 工業(yè)微生物大多基因背景不清晰，合成目標(biāo)產(chǎn)物代謝途徑復(fù)雜，對其代謝途徑關(guān)鍵酶調(diào)控機制以及微生物基因型和代謝功能表型之間的關(guān)系缺乏分子水平上認(rèn)識，對途徑中某個或多個酶進行調(diào)控，往往不能實現(xiàn)預(yù)期的效果，而代謝組學(xué)的生化水平表征最接近于細(xì)胞功能狀態(tài)的反映，因此利用代謝組學(xué)來全面理解微生物生理功能是最有效的?；ㄉ南┧幔ˋRA）是一種重要多不飽和脂肪酸（PUFAs）,對人的生理活動起著十分重要的作用，被譽為新一代功能保健因子。 本作品以花生四烯酸（ARA）高產(chǎn)菌株M.alpina為研究對象，針對該工業(yè)微生物發(fā)酵中的共性問題，提出代謝組學(xué)的研究方法，搭建微生物微觀代謝信息和宏觀發(fā)酵調(diào)控的橋梁，以實現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的高產(chǎn)。 本作品以實驗室誘變篩選得到的三株高產(chǎn)花生四烯酸的M. alpina菌株（Y1，Y2，Y3）為研究對象，通過三個層次分析出代謝產(chǎn)物中與目標(biāo)產(chǎn)物積累相關(guān)的小分子，并將其作為調(diào)控因子進行研究分析，以促使ARA在M.alpina中高效合成。 1、基于代謝組學(xué)的代謝組信息獲取 在代謝組學(xué)研究過程中，樣品制備是其中第一步也是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，代謝產(chǎn)物是否能夠?qū)崟r的、準(zhǔn)確的、全面的獲得關(guān)系到后續(xù)分析及數(shù)據(jù)處理后得出的代謝產(chǎn)物及生命特征的相關(guān)性是否可靠。為獲得具有代表性的樣品，分析時的樣品的代謝組成分必須保證與取樣時一致，才能反應(yīng)樣品當(dāng)時的代謝活動，因此這一反映特定生理狀態(tài)的代謝狀態(tài)必須要被“固定”?。ùx淬火），直到分析完成，這是取樣的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?；诓煌N的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同，對滲透壓的耐受程度不同以及膜的通透性差異的考慮，本作品設(shè)計三種淬火方案：甲醇淬火、液氮淬火、液氮淬火與研磨，并從中篩選出最優(yōu)的淬火方案。 2、基于三株高產(chǎn)菌代謝組差異的主成分確定 通過對三株高產(chǎn)菌株的GC-MS圖譜進行對比分析不同菌株的代謝異同，找出了高產(chǎn)菌株中的18種共有代謝產(chǎn)物，采用主成分分析法對共有代謝物進行歸類分析，得到兩個主成分。一個指向細(xì)胞生長的主成分，其指標(biāo)物包括胱氨酸，沒食子酸，天冬酰胺，葡萄糖，纈氨酸，丁酸；一個指向ARA合成的主成分其指標(biāo)物包括前列腺素、賴氨酸、蝶啶、丁醇、甘氨酸、半乳糖、乙酸、棕櫚酸、硬脂酸。同時也大致確定了胞內(nèi)代謝物與生物質(zhì)及ARA單產(chǎn)水平的關(guān)系，并以從中篩選出的指標(biāo)物作為調(diào)控因子，此代謝組學(xué)的分析方法為發(fā)酵調(diào)控提供了新的角度。 3、基于刺激-響應(yīng)的代謝調(diào)控 本作品利用由代謝組學(xué)分析得到的與目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量相關(guān)的小分子物質(zhì)作為調(diào)控因子，在發(fā)酵產(chǎn)ARA的過程中，在發(fā)酵的不同階段探索性的添加賴氨酸、沒食子酸和乙酸三種目標(biāo)產(chǎn)物相關(guān)因子，同時考慮到發(fā)酵后期碳源的耗盡，為實現(xiàn)更好的調(diào)控性能，本作品在發(fā)酵后期流加了葡萄糖。結(jié)果顯示：沒食子酸的添加主要影響了生物量的積累，最高的生物量為41.3g/L，乙酸的添加對生物量和ARA含量的影響不確定，賴氨酸的添加使ARA的含量不斷增加，在發(fā)酵后期使得ARA在總脂肪酸的含量由調(diào)控前的56.2% 增大到75%,此時ARA含量為19.8g/l，達(dá)到國際領(lǐng)先水平。實驗結(jié)果論證了代謝組學(xué)在工業(yè)微生物的發(fā)酵調(diào)控中的有效性。 本作品利用代謝組學(xué)新方法調(diào)控M. alpine 發(fā)酵，實現(xiàn)了高產(chǎn)ARA。已與江蘇天凱生物科技有限公司合作，進入產(chǎn)業(yè)化試用階段。代謝組學(xué)在M. alpine發(fā)酵產(chǎn)花生四烯酸的成功應(yīng)用為從根本上解決微生物油脂積累的技術(shù)難題提供了新的視角和手段，也為從代謝組學(xué)層次進一步提升ARA發(fā)酵生產(chǎn)能力提供了理論依據(jù)和方法指導(dǎo)，有利于增強對微生物細(xì)胞代謝調(diào)控理解和認(rèn)識，推動工業(yè)生物技術(shù)的發(fā)展。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 高山被孢霉是發(fā)酵合成花生四烯酸（ARA）最高的工業(yè)微生物，基于基因和代謝工程的傳統(tǒng)調(diào)控方法存在一定局限性，因此尋求新的平臺搭建微生物微觀信息和宏觀表型的橋梁是解決工業(yè)微生物發(fā)酵問題的關(guān)鍵。本作品利用代謝組學(xué)對ARA合成過程中代謝產(chǎn)物的分析，尋找與ARA產(chǎn)量相關(guān)的小分子，并選取一部分作為調(diào)控因子，考察不同添加時間下的生物量、ARA含量，獲得最優(yōu)的添加方案，進而實現(xiàn)ARA在高山被孢霉中的高效合成。
科學(xué)性、先進性及獨特之處
- 本作品利用高通量代謝組學(xué)的方法跳過了基因操作的壁壘，較為全面地解析代謝產(chǎn)物，分析出和目標(biāo)產(chǎn)物相關(guān)的調(diào)控因子，提出了有針對進行代謝調(diào)控的思路；針對傳統(tǒng)調(diào)控單個節(jié)點有效性差、局限性過多等缺點，提出了一個針對高山被孢霉的全新研究思路: 利用代謝組學(xué)的研究方法得到與ARA產(chǎn)量相關(guān)小分子，然后針對該小分子定向調(diào)控使ARA在高山被孢霉體內(nèi)高效合成，為代謝途徑復(fù)雜的微生物的代謝調(diào)控提供了一種可控、高效的方法。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 作品用代謝組學(xué)新方法調(diào)控高山被孢霉使ARA發(fā)酵達(dá)到世界領(lǐng)先水平，增強了ARA與國外生產(chǎn)技術(shù)的競爭力，并與江蘇天凱生物科技有限公司合作，進入產(chǎn)業(yè)化試用階段。為從根本上解決微生物油脂積累的技術(shù)難題提供新的視角和手段，也從代謝組學(xué)層次提升ARA發(fā)酵生產(chǎn)能力提供方法指導(dǎo)，為基因背景不清晰，代謝網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜的微生物代謝調(diào)控的研究提供了新的思路，有利于增強對微生物細(xì)胞代謝調(diào)控理解和認(rèn)識，推動工業(yè)生物技術(shù)的發(fā)展。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 花生四烯酸（ARA）是一種重要多不飽和脂肪酸（PUFAs）,對人的生理活動起著十分重要的作用，被譽為新一代功能保健因子。本作品以花生四烯酸（ARA）生產(chǎn)菌高山被孢霉（M. alpina）為研究對象，通過對相同培養(yǎng)條件下不同菌株的代謝產(chǎn)物進行分析，完善代謝產(chǎn)物提取方法，優(yōu)化數(shù)據(jù)處理，快捷獲取數(shù)據(jù)信息，尋找出與ARA產(chǎn)量相關(guān)的共性小分子代謝物，將其作為調(diào)控因子，最終發(fā)現(xiàn)沒食子酸的添加主要影響了生物量的積累最高的生物量為41.3g/L，乙酸的添加對生物量和ARA含量的影響不確定，賴氨酸的添加使ARA的含量不斷增加，在發(fā)酵后期使得ARA在總脂肪酸中的含量由調(diào)控前的56.2% 增大到75%,此時ARA含量達(dá)到19.8g/L，是已有文獻報道的最高值。
獲獎情況
- 無
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻
- [1] Villas-Boas SG, Rasmussen S. Metabolomics or metabolite profiles. Trends in Biotechnology, 2005, 23: 385-386. [2] Villas-Boas SG, et al Metabolomics or metabolite profiles. Trends in Biotechnology, 2005, 23: 385-386 [3] Blow N. Metabolomics:Biochemistry's new look. Nature, 2008, 455: 697-700.
同類課題研究水平概述
- 據(jù)文獻報道，低等真菌特別是被孢霉屬中的Mortierella亞屬真菌體內(nèi)含有大量的ARA，如：高山被孢霉、長被孢霉、深黃被孢霉等，通過對50多種亞屬分析，發(fā)現(xiàn)高山被孢霉的ARA產(chǎn)量最高。具體研究內(nèi)容主要體現(xiàn)在以下幾個方面： 分子機理方面：主要集中在ARA合成途徑某一關(guān)鍵酶或基因的調(diào)控方面，而國內(nèi)這方面的研究則很少。04年Sakuradani E.等通過篩選具有低n-3脫飽和酶活性的高山被孢霉突變株來提高ARA產(chǎn)率。05年Sakayu Shimizu從分子機理上說明高山被孢霉合成ARA的限速步驟主要是從C18:3到C20:3的延伸。國內(nèi)周蓬蓬等在02年研究了己糖單磷酸途徑在被孢霉生產(chǎn)ARA中的作用，并對葡萄糖-6-磷酸脫氫酶進行調(diào)控以促進ARA的積累。 生產(chǎn)方式分析：ARA發(fā)酵生產(chǎn)常用培養(yǎng)方式有分批式，連續(xù)式和流加式。05年Byung-Hae Hwang等在12L發(fā)酵罐中進行補料發(fā)酵培養(yǎng)高山被孢霉，每次間歇加入32g/L葡萄糖，14%(v/v) NH4OH， 最終ARA含量為18.8g/L，比分批發(fā)酵高1.8-4倍。 動力學(xué)分析：由于在同一時期菌體生長和油脂的合成不是平行的，國內(nèi)對這方面進行了充分的研究，并建立了菌體生長和油脂形成、氮源與葡萄糖雙底物限制動力學(xué)模型及合成ARA的代謝通量模型，實現(xiàn)了發(fā)酵碳流遷移，提高了發(fā)酵產(chǎn)量。雖然國內(nèi)外對ARA發(fā)酵生產(chǎn)做了大量的研究工作，但由于合成ARA菌種基因背景不清晰、代謝途徑復(fù)雜，單純對代謝途徑某個或多個酶或基因進行調(diào)控，往往不能實現(xiàn)預(yù)期的效果。代謝組學(xué)是應(yīng)用現(xiàn)代分析方法對某生物或細(xì)胞在特定生理時期內(nèi)所有相對分子質(zhì)量較低的代謝產(chǎn)物進行定性和定量分析的一門新興學(xué)科，自1998年提出后，其主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和植物學(xué)等領(lǐng)域，近年來，逐漸向微生物領(lǐng)域滲透，也取得了一定的成果。 Werf MJ van der等利用多參數(shù)模式識別技術(shù)，分析整合全面的、動態(tài)的代謝反應(yīng)信息用于瓶頸因素的無偏分析和排序，進行指導(dǎo)菌種改良和關(guān)鍵培養(yǎng)基組分的確定。但國內(nèi)代謝組學(xué)用于微生物領(lǐng)域的報道比較少。 綜上所述，代謝組學(xué)在基礎(chǔ)科學(xué)領(lǐng)域提供了一種先進的理念，其最大的特點就是從表型著手回答其他組學(xué)不能回答的生物問題，因此利用代謝組學(xué)來全面理解微生物生理功能是最有效的，為基因背景不清晰、代謝途徑復(fù)雜的微生物代謝調(diào)控的研究提供了新思路和新方法。
