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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 基于代謝組學(xué)新方法調(diào)控新型功能因子花生四烯酸高效生物合成
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 花生四烯酸（Arachidonic acid，簡(jiǎn)稱ARA，即5,8,11,14-二十碳四烯酸）是一種重要的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（PUFAs），廣泛應(yīng)用于功能保健、生物醫(yī)藥、化妝品及飼料添加劑等方面。在發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸的菌種之中，高山被孢霉（M. alpina ）被認(rèn)為是最優(yōu)良的菌種，但其屬于基因背景不清楚，代謝網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜的工業(yè)微生物，利用傳統(tǒng)的代謝工程和基因工程方法來解決此類微生物發(fā)酵問題具有一定復(fù)雜性和局限性。而新發(fā)展起來的代謝組學(xué)則能夠搭建微生物微觀信息和宏觀表型的橋梁，從而解決工業(yè)微生物發(fā)酵的關(guān)鍵問題。 本作品以實(shí)驗(yàn)室篩選的三株ARA高產(chǎn)菌株M. alpina為研究對(duì)象，利用代謝組學(xué)新方法獲取在ARA生產(chǎn)過程中與產(chǎn)量和菌體生物量相關(guān)的小分子代謝物，并將其作為調(diào)控因子調(diào)控ARA的高效生物合成，使ARA在總脂肪酸中的含量由調(diào)控前的56.2% 增大到調(diào)控后的75%，ARA含量高達(dá)19.8g/l，達(dá)到國際領(lǐng)先水平。該代謝組學(xué)新方法為其它基因背景不清晰、代謝途徑復(fù)雜的工業(yè)微生物的代謝調(diào)控提供了一種簡(jiǎn)單快速、可控高效的思路和手段。 目前，本作品中涉及的ARA生產(chǎn)與調(diào)控方法已與江蘇天凱生物科技有限公司合作，進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化中試階段，該技術(shù)方法增強(qiáng)了與國外ARA生產(chǎn)技術(shù)的競(jìng)爭(zhēng)力，為擺脫國內(nèi)奶制品和制藥等行業(yè)對(duì)國外高品質(zhì)ARA供應(yīng)商的依賴具有重要意義。
- 詳細(xì)介紹：
- 工業(yè)微生物大多基因背景不清晰，合成目標(biāo)產(chǎn)物代謝途徑復(fù)雜，對(duì)其代謝途徑關(guān)鍵酶調(diào)控機(jī)制以及微生物基因型和代謝功能表型之間的關(guān)系缺乏分子水平上認(rèn)識(shí)，對(duì)途徑中某個(gè)或多個(gè)酶進(jìn)行調(diào)控，往往不能實(shí)現(xiàn)預(yù)期的效果，而代謝組學(xué)的生化水平表征最接近于細(xì)胞功能狀態(tài)的反映，因此利用代謝組學(xué)來全面理解微生物生理功能是最有效的?；ㄉ南┧幔ˋRA）是一種重要多不飽和脂肪酸（PUFAs）,對(duì)人的生理活動(dòng)起著十分重要的作用，被譽(yù)為新一代功能保健因子。 本作品以花生四烯酸（ARA）高產(chǎn)菌株M.alpina為研究對(duì)象，針對(duì)該工業(yè)微生物發(fā)酵中的共性問題，提出代謝組學(xué)的研究方法，搭建微生物微觀代謝信息和宏觀發(fā)酵調(diào)控的橋梁，以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的高產(chǎn)。 本作品以實(shí)驗(yàn)室誘變篩選得到的三株高產(chǎn)花生四烯酸的M. alpina菌株（Y1，Y2，Y3）為研究對(duì)象，通過三個(gè)層次分析出代謝產(chǎn)物中與目標(biāo)產(chǎn)物積累相關(guān)的小分子，并將其作為調(diào)控因子進(jìn)行研究分析，以促使ARA在M.alpina中高效合成。 1、基于代謝組學(xué)的代謝組信息獲取 在代謝組學(xué)研究過程中，樣品制備是其中第一步也是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，代謝產(chǎn)物是否能夠?qū)崟r(shí)的、準(zhǔn)確的、全面的獲得關(guān)系到后續(xù)分析及數(shù)據(jù)處理后得出的代謝產(chǎn)物及生命特征的相關(guān)性是否可靠。為獲得具有代表性的樣品，分析時(shí)的樣品的代謝組成分必須保證與取樣時(shí)一致，才能反應(yīng)樣品當(dāng)時(shí)的代謝活動(dòng)，因此這一反映特定生理狀態(tài)的代謝狀態(tài)必須要被“固定”?。ùx淬火），直到分析完成，這是取樣的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?；诓煌N的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同，對(duì)滲透壓的耐受程度不同以及膜的通透性差異的考慮，本作品設(shè)計(jì)三種淬火方案：甲醇淬火、液氮淬火、液氮淬火與研磨，并從中篩選出最優(yōu)的淬火方案。 2、基于三株高產(chǎn)菌代謝組差異的主成分確定 通過對(duì)三株高產(chǎn)菌株的GC-MS圖譜進(jìn)行對(duì)比分析不同菌株的代謝異同，找出了高產(chǎn)菌株中的18種共有代謝產(chǎn)物，采用主成分分析法對(duì)共有代謝物進(jìn)行歸類分析，得到兩個(gè)主成分。一個(gè)指向細(xì)胞生長(zhǎng)的主成分，其指標(biāo)物包括胱氨酸，沒食子酸，天冬酰胺，葡萄糖，纈氨酸，丁酸；一個(gè)指向ARA合成的主成分其指標(biāo)物包括前列腺素、賴氨酸、蝶啶、丁醇、甘氨酸、半乳糖、乙酸、棕櫚酸、硬脂酸。同時(shí)也大致確定了胞內(nèi)代謝物與生物質(zhì)及ARA單產(chǎn)水平的關(guān)系，并以從中篩選出的指標(biāo)物作為調(diào)控因子，此代謝組學(xué)的分析方法為發(fā)酵調(diào)控提供了新的角度。 3、基于刺激-響應(yīng)的代謝調(diào)控 本作品利用由代謝組學(xué)分析得到的與目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量相關(guān)的小分子物質(zhì)作為調(diào)控因子，在發(fā)酵產(chǎn)ARA的過程中，在發(fā)酵的不同階段探索性的添加賴氨酸、沒食子酸和乙酸三種目標(biāo)產(chǎn)物相關(guān)因子，同時(shí)考慮到發(fā)酵后期碳源的耗盡，為實(shí)現(xiàn)更好的調(diào)控性能，本作品在發(fā)酵后期流加了葡萄糖。結(jié)果顯示：沒食子酸的添加主要影響了生物量的積累，最高的生物量為41.3g/L，乙酸的添加對(duì)生物量和ARA含量的影響不確定，賴氨酸的添加使ARA的含量不斷增加，在發(fā)酵后期使得ARA在總脂肪酸的含量由調(diào)控前的56.2% 增大到75%,此時(shí)ARA含量為19.8g/l，達(dá)到國際領(lǐng)先水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果論證了代謝組學(xué)在工業(yè)微生物的發(fā)酵調(diào)控中的有效性。 本作品利用代謝組學(xué)新方法調(diào)控M. alpine 發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)ARA。已與江蘇天凱生物科技有限公司合作，進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化試用階段。代謝組學(xué)在M. alpine發(fā)酵產(chǎn)花生四烯酸的成功應(yīng)用為從根本上解決微生物油脂積累的技術(shù)難題提供了新的視角和手段，也為從代謝組學(xué)層次進(jìn)一步提升ARA發(fā)酵生產(chǎn)能力提供了理論依據(jù)和方法指導(dǎo)，有利于增強(qiáng)對(duì)微生物細(xì)胞代謝調(diào)控理解和認(rèn)識(shí)，推動(dòng)工業(yè)生物技術(shù)的發(fā)展。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 高山被孢霉是發(fā)酵合成花生四烯酸（ARA）最高的工業(yè)微生物，基于基因和代謝工程的傳統(tǒng)調(diào)控方法存在一定局限性，因此尋求新的平臺(tái)搭建微生物微觀信息和宏觀表型的橋梁是解決工業(yè)微生物發(fā)酵問題的關(guān)鍵。本作品利用代謝組學(xué)對(duì)ARA合成過程中代謝產(chǎn)物的分析，尋找與ARA產(chǎn)量相關(guān)的小分子，并選取一部分作為調(diào)控因子，考察不同添加時(shí)間下的生物量、ARA含量，獲得最優(yōu)的添加方案，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)ARA在高山被孢霉中的高效合成。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 本作品利用高通量代謝組學(xué)的方法跳過了基因操作的壁壘，較為全面地解析代謝產(chǎn)物，分析出和目標(biāo)產(chǎn)物相關(guān)的調(diào)控因子，提出了有針對(duì)進(jìn)行代謝調(diào)控的思路；針對(duì)傳統(tǒng)調(diào)控單個(gè)節(jié)點(diǎn)有效性差、局限性過多等缺點(diǎn)，提出了一個(gè)針對(duì)高山被孢霉的全新研究思路: 利用代謝組學(xué)的研究方法得到與ARA產(chǎn)量相關(guān)小分子，然后針對(duì)該小分子定向調(diào)控使ARA在高山被孢霉體內(nèi)高效合成，為代謝途徑復(fù)雜的微生物的代謝調(diào)控提供了一種可控、高效的方法。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 作品用代謝組學(xué)新方法調(diào)控高山被孢霉使ARA發(fā)酵達(dá)到世界領(lǐng)先水平，增強(qiáng)了ARA與國外生產(chǎn)技術(shù)的競(jìng)爭(zhēng)力，并與江蘇天凱生物科技有限公司合作，進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化試用階段。為從根本上解決微生物油脂積累的技術(shù)難題提供新的視角和手段，也從代謝組學(xué)層次提升ARA發(fā)酵生產(chǎn)能力提供方法指導(dǎo)，為基因背景不清晰，代謝網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜的微生物代謝調(diào)控的研究提供了新的思路，有利于增強(qiáng)對(duì)微生物細(xì)胞代謝調(diào)控理解和認(rèn)識(shí)，推動(dòng)工業(yè)生物技術(shù)的發(fā)展。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 花生四烯酸（ARA）是一種重要多不飽和脂肪酸（PUFAs）,對(duì)人的生理活動(dòng)起著十分重要的作用，被譽(yù)為新一代功能保健因子。本作品以花生四烯酸（ARA）生產(chǎn)菌高山被孢霉（M. alpina）為研究對(duì)象，通過對(duì)相同培養(yǎng)條件下不同菌株的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，完善代謝產(chǎn)物提取方法，優(yōu)化數(shù)據(jù)處理，快捷獲取數(shù)據(jù)信息，尋找出與ARA產(chǎn)量相關(guān)的共性小分子代謝物，將其作為調(diào)控因子，最終發(fā)現(xiàn)沒食子酸的添加主要影響了生物量的積累最高的生物量為41.3g/L，乙酸的添加對(duì)生物量和ARA含量的影響不確定，賴氨酸的添加使ARA的含量不斷增加，在發(fā)酵后期使得ARA在總脂肪酸中的含量由調(diào)控前的56.2% 增大到75%,此時(shí)ARA含量達(dá)到19.8g/L，是已有文獻(xiàn)報(bào)道的最高值。
獲獎(jiǎng)情況
- 無
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻(xiàn)
- [1] Villas-Boas SG, Rasmussen S. Metabolomics or metabolite profiles. Trends in Biotechnology, 2005, 23: 385-386. [2] Villas-Boas SG, et al Metabolomics or metabolite profiles. Trends in Biotechnology, 2005, 23: 385-386 [3] Blow N. Metabolomics:Biochemistry's new look. Nature, 2008, 455: 697-700.
同類課題研究水平概述
- 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，低等真菌特別是被孢霉屬中的Mortierella亞屬真菌體內(nèi)含有大量的ARA，如：高山被孢霉、長(zhǎng)被孢霉、深黃被孢霉等，通過對(duì)50多種亞屬分析，發(fā)現(xiàn)高山被孢霉的ARA產(chǎn)量最高。具體研究?jī)?nèi)容主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面： 分子機(jī)理方面：主要集中在ARA合成途徑某一關(guān)鍵酶或基因的調(diào)控方面，而國內(nèi)這方面的研究則很少。04年Sakuradani E.等通過篩選具有低n-3脫飽和酶活性的高山被孢霉突變株來提高ARA產(chǎn)率。05年Sakayu Shimizu從分子機(jī)理上說明高山被孢霉合成ARA的限速步驟主要是從C18:3到C20:3的延伸。國內(nèi)周蓬蓬等在02年研究了己糖單磷酸途徑在被孢霉生產(chǎn)ARA中的作用，并對(duì)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶進(jìn)行調(diào)控以促進(jìn)ARA的積累。 生產(chǎn)方式分析：ARA發(fā)酵生產(chǎn)常用培養(yǎng)方式有分批式，連續(xù)式和流加式。05年Byung-Hae Hwang等在12L發(fā)酵罐中進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)高山被孢霉，每次間歇加入32g/L葡萄糖，14%(v/v) NH4OH， 最終ARA含量為18.8g/L，比分批發(fā)酵高1.8-4倍。 動(dòng)力學(xué)分析：由于在同一時(shí)期菌體生長(zhǎng)和油脂的合成不是平行的，國內(nèi)對(duì)這方面進(jìn)行了充分的研究，并建立了菌體生長(zhǎng)和油脂形成、氮源與葡萄糖雙底物限制動(dòng)力學(xué)模型及合成ARA的代謝通量模型，實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵碳流遷移，提高了發(fā)酵產(chǎn)量。雖然國內(nèi)外對(duì)ARA發(fā)酵生產(chǎn)做了大量的研究工作，但由于合成ARA菌種基因背景不清晰、代謝途徑復(fù)雜，單純對(duì)代謝途徑某個(gè)或多個(gè)酶或基因進(jìn)行調(diào)控，往往不能實(shí)現(xiàn)預(yù)期的效果。代謝組學(xué)是應(yīng)用現(xiàn)代分析方法對(duì)某生物或細(xì)胞在特定生理時(shí)期內(nèi)所有相對(duì)分子質(zhì)量較低的代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析的一門新興學(xué)科，自1998年提出后，其主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和植物學(xué)等領(lǐng)域，近年來，逐漸向微生物領(lǐng)域滲透，也取得了一定的成果。 Werf MJ van der等利用多參數(shù)模式識(shí)別技術(shù)，分析整合全面的、動(dòng)態(tài)的代謝反應(yīng)信息用于瓶頸因素的無偏分析和排序，進(jìn)行指導(dǎo)菌種改良和關(guān)鍵培養(yǎng)基組分的確定。但國內(nèi)代謝組學(xué)用于微生物領(lǐng)域的報(bào)道比較少。 綜上所述，代謝組學(xué)在基礎(chǔ)科學(xué)領(lǐng)域提供了一種先進(jìn)的理念，其最大的特點(diǎn)就是從表型著手回答其他組學(xué)不能回答的生物問題，因此利用代謝組學(xué)來全面理解微生物生理功能是最有效的，為基因背景不清晰、代謝途徑復(fù)雜的微生物代謝調(diào)控的研究提供了新思路和新方法。
