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基本信息
- 項目名稱：
- 大腸桿菌內(nèi)基因計時開關(guān)的設(shè)計及應(yīng)用
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 大類：
- 科技發(fā)明制作A類
- 簡介：
- 大腸桿菌內(nèi)基因計時開關(guān)的設(shè)計及應(yīng)用 分類：科技發(fā)明制作，D類 摘要： 大腸桿菌是目前應(yīng)用最為廣泛的外源蛋白表達(dá)體系，該體系通常采用單一啟動子調(diào)控目的蛋白表達(dá)，這種調(diào)控往往是一不可逆過程。而生物體內(nèi)有許多蛋白只在一段時間內(nèi)進(jìn)行表達(dá)的，因而建立一種簡單可控的基因開關(guān)模型，對研究這些蛋白的表達(dá)與功能具有重要意義。 本發(fā)明設(shè)計了一種“基因計時開關(guān)”用以控制大腸桿菌在某一時段內(nèi)表達(dá)特定目的蛋白?；蛴嫊r開關(guān)是一個由阿拉伯糖操縱子和乳糖操縱子組成的基因反饋調(diào)節(jié)回路，模型中以綠色熒光蛋白（GFP）和紅色熒光蛋白(RFP)為報告基因，顯示其工作狀態(tài)（見項目圖片1)。 當(dāng)培養(yǎng)基中沒有阿拉伯糖時，阿拉伯糖操縱子處于阻遏狀態(tài)，乳糖操縱子控制RFP表達(dá)，開關(guān)處于“關(guān)閉”狀態(tài)；當(dāng)培養(yǎng)基中加入阿拉伯糖后，阿拉伯操縱子解阻遏啟動GFP表達(dá)，顯示開關(guān)打開。同時表達(dá)LacI阻遏乳糖操縱子，關(guān)閉RFP的表達(dá)。當(dāng)阿拉伯糖完全降解后，基因計時開關(guān)重新關(guān)閉。 該發(fā)明于2008年11月8～9日在由美國麻省理工學(xué)院主辦的國際基因工程機(jī)器設(shè)計競賽（iGEM）中獲得銅獎。
- 詳細(xì)介紹：
- 大腸桿菌內(nèi)基因計時開關(guān)的設(shè)計及應(yīng)用 摘要： 利用合成生物學(xué)的方法，在大腸桿菌中構(gòu)造一個穩(wěn)定、可控的“基因計時開關(guān)”，通過本發(fā)明設(shè)計，基因生物計時開關(guān)可以對大腸桿菌外的L-阿拉伯糖分子濃度信號做出響應(yīng)，從而實現(xiàn)對計時開關(guān)的定時控制。這一發(fā)明可以調(diào)控大腸桿菌在某一特定時段內(nèi)表達(dá)特定目的蛋白，不僅可以用于對瞬時表達(dá)蛋白質(zhì)的功能研究，也在工業(yè)發(fā)酵中利用大腸桿菌對外界調(diào)控因素的響應(yīng)實現(xiàn)精密的自我調(diào)控。 大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的宿主，遺傳背景清楚，培養(yǎng)條件簡單，操作方法簡便，是目前生物技術(shù)領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的表達(dá)體系。用大腸桿菌表達(dá)外源性蛋白的時候，通常采用單一啟動子進(jìn)行調(diào)控，即：當(dāng)大腸桿菌生長到一定時期，加入誘導(dǎo)劑或改變外界環(huán)境因素，誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。但這種調(diào)節(jié)往往是單向的，不可逆的過程。而生物體內(nèi)有許多蛋白的表達(dá)是時序性的，即：只在特定條件下，或特定時間段內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。因而，建立一種簡單可控的基因開關(guān)模型，對研究這些瞬時表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能具有重要意義。 為了使大腸桿菌內(nèi)的外源蛋白能進(jìn)行可調(diào)控的時序表達(dá)，我們設(shè)計了一種“基因計時開關(guān)”，這種計時開關(guān)可以控制大腸桿菌在某一特定時段內(nèi)表達(dá)特定目的蛋白，可以用于對瞬時表達(dá)蛋白質(zhì)的功能研究。 基因計時開關(guān)其基本組成如圖1所示（見項目圖片1）： 其中：araC+PBAD為阿拉伯糖操縱子，LacI為乳糖操縱子的調(diào)節(jié)基因，PL是乳糖啟動子，GFP為綠色熒光蛋白，RFP為紅色熒光蛋白。 根據(jù)上述目的基因構(gòu)建“基因計時開關(guān)”的質(zhì)粒圖譜如圖2所示(見項目圖片2)，其工作原理是在大腸桿菌中構(gòu)建一個由阿拉伯糖操縱子和乳糖操縱子組成的基因反饋調(diào)節(jié)回路，同時以綠色熒光蛋白（GFP）和紅色熒光蛋白(RFP)為報告基因，顯示基因計時開關(guān)的工作狀態(tài)。 基因計時開關(guān)主要工作原理是以可以解除阿拉伯糖操縱子阻遏狀態(tài)的阿拉伯糖作為調(diào)控分子，控制計時器的開關(guān)狀態(tài)和工作時間。當(dāng)培養(yǎng)基中沒有加入L-阿拉伯糖時，阿拉伯糖操縱子處于阻遏狀態(tài)，乳糖操縱子控制RFP的表達(dá)，表明基因計時器處于“未計時”狀態(tài)；當(dāng)在培養(yǎng)基中加入一定濃度的L-阿拉伯糖后，阿拉伯操縱子解阻遏，調(diào)節(jié)基因LacI表達(dá)，使乳糖操縱子受到阻遏，抑制RFP的表達(dá)，同時阿拉伯糖啟動子啟動GFP的表達(dá)，顯示計時開關(guān)開始計時。當(dāng)培養(yǎng)基中L-阿拉伯糖完全降解后，阿拉伯糖操縱子重新回到阻遏狀態(tài)，阻斷GFP的表達(dá)，乳糖啟動子再次啟動RFP的表達(dá)，此時基因計時器完成計時工作。 報告基因的表達(dá)順序和狀態(tài)如下圖所示(見項目圖片5)： 同時，我們可以通過調(diào)節(jié)L-阿拉伯糖的濃度來調(diào)控基因計時開關(guān)工作時間的長短，從而達(dá)到為計時開關(guān)定時的目的。另外，在基因計時開關(guān)工作過程中，菌體培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)基的成分也會對計時周期的長短產(chǎn)生影響。在實際應(yīng)用中，可以用某些目的基因替換GFP和RFP報告基因，從而使不同蛋白在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行可控的順序表達(dá)。 本發(fā)明可以使大腸桿菌內(nèi)的外源蛋白能進(jìn)行可調(diào)控的時序表達(dá)，可用于研究瞬時表達(dá)蛋白質(zhì)的功能。此外，也可利用大腸桿菌對外源調(diào)控分子的響應(yīng)，實現(xiàn)工業(yè)發(fā)酵中的自響應(yīng)式的自動控制。
作品圖片
作品專業(yè)信息
設(shè)計、發(fā)明的目的和基本思路、創(chuàng)新點(diǎn)、技術(shù)關(guān)鍵和主要技術(shù)指標(biāo)
- 設(shè)計目的：大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的宿主，遺傳背景清楚，培養(yǎng)條件簡單，操作方法簡便，是目前生物技術(shù)領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的表達(dá)體系。為了使大腸桿菌內(nèi)的外源蛋白能進(jìn)行可調(diào)控的時序表達(dá)，我們設(shè)計了一種“基因計時開關(guān)”，這種計時開關(guān)可以控制大腸桿菌在某一特定時段內(nèi)表達(dá)特定目的蛋白，不僅可以用于對瞬時表達(dá)蛋白質(zhì)的功能研究，也在工業(yè)發(fā)酵中利用大腸桿菌對外界調(diào)控因素的響應(yīng)實現(xiàn)精密的自我調(diào)控。 基本設(shè)計思路：“基因計時開關(guān)”的工作原理是在大腸桿菌中構(gòu)建一個由阿拉伯糖操縱子和乳糖操縱子組成的基因反饋調(diào)節(jié)回路，同時以綠色熒光蛋白（GFP）和紅色熒光蛋白(RFP)為報告基因，顯示基因計時開關(guān)的工作狀態(tài)。通過調(diào)節(jié)L-阿拉伯糖的濃度來調(diào)控基因計時器工作時間的長短，從而達(dá)到為計時器定時的目的；另外菌體培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)基成分也對基因計時器工作時間的長短有影響。在實際應(yīng)用中，可以用某些目的基因替換GFP和RFP報告基因，從而使不同蛋白在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行可控的順序表達(dá)，用于某些蛋白質(zhì)瞬時表達(dá)模型的研究。 創(chuàng)新點(diǎn)：利用兩個精密調(diào)控的操縱子使大腸桿菌內(nèi)目的基因能進(jìn)行時序調(diào)控性表達(dá)，并使之能夠?qū)ν饨缯{(diào)控分子做出響應(yīng)，可根據(jù)需要控制目標(biāo)蛋白實現(xiàn)一定時段的定時表達(dá)。這一調(diào)控模型可用于某些瞬時表達(dá)蛋白的功能研究，同時也可用于大腸桿菌發(fā)酵表達(dá)的自動控制。 技術(shù)關(guān)鍵：通過阿拉伯糖操縱子和乳糖操縱子構(gòu)建一個精密調(diào)控的反饋回路，利用阿拉伯糖操縱子精密調(diào)控、易于誘導(dǎo)的性質(zhì)實現(xiàn)目的蛋白的時序性表達(dá)。
科學(xué)性、先進(jìn)性
- 目前，大部分利用大腸桿菌對目的蛋白的表達(dá)的調(diào)控手段是利用單一啟動子進(jìn)行調(diào)控，在加入某種誘導(dǎo)劑后誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，但這種誘導(dǎo)表達(dá)通常是單向的、不可逆的。 本發(fā)明利用了兩個精密調(diào)控的啟動子，通過反饋回路實現(xiàn)了目的蛋白表達(dá)的時序性調(diào)控，使目的蛋白可以在一段可控的時間段內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，并可以在大腸桿菌的生長周期內(nèi)重復(fù)開關(guān)此目的蛋白的表達(dá)。此模型不僅可以用于大腸桿菌發(fā)酵過程的控制，也可用于某些瞬時表達(dá)的蛋白質(zhì)功能的研究。
獲獎情況及鑒定結(jié)果
- 該作品于2008年11月8～9日在由美國麻省理工學(xué)院（Massachusetts Institute of Technology，MIT）主辦的國際基因工程機(jī)器設(shè)計競賽（International Genetically Engineered Machine Competition，iGEM）中獲得銅獎
作品所處階段
- 實驗室階段
技術(shù)轉(zhuǎn)讓方式
作品可展示的形式
- 圖片
使用說明,技術(shù)特點(diǎn)和優(yōu)勢,適應(yīng)范圍,推廣前景的技術(shù)性說明,市場分析,經(jīng)濟(jì)效益預(yù)測
- 本發(fā)明的主要技術(shù)優(yōu)勢是實現(xiàn)了大腸桿菌發(fā)酵過程中目的蛋白表達(dá)的時序性控制。使目的蛋白可以在一段可控的時間段內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，并可以在大腸桿菌的生長周期內(nèi)重復(fù)開關(guān)此目的蛋白的表達(dá)。 本發(fā)明一方面可以用于大腸桿菌發(fā)酵過程的控制，利用大腸桿菌對調(diào)控分子的響應(yīng)，實現(xiàn)自響應(yīng)式的表達(dá)調(diào)控，在工業(yè)發(fā)酵的自動控制中能獲得良好的應(yīng)用前景。同時，本發(fā)明也可用于建立某些瞬時表達(dá)的蛋白質(zhì)功能研究的模型，為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究提供了一種有效而方便的基因調(diào)控模型。
同類課題研究水平概述
- 合成生物學(xué)是新出現(xiàn)的一門交叉學(xué)科，具有迅猛的發(fā)展勢頭和廣闊的發(fā)展前景。它借鑒工程化的思想來研究生命，最終目標(biāo)是創(chuàng)造人工生命體，涵蓋分子生物學(xué)、工程學(xué)、數(shù)學(xué)、物理學(xué)等許多研究領(lǐng)域。 在國外合成生物學(xué)的研究受到科技發(fā)達(dá)國家的高度重視，在美國和瑞士已成功地召開了三屆國際合成生物學(xué)會議, 歐洲首屆合成生物學(xué)會議也于2007年底在西班牙成功召開, 著名的美國洛倫茲?貝克萊國家實驗室在國際上首次建立了合成生物學(xué)部等等。2000年以來, 國外的合成生物學(xué)取得了很大進(jìn)展, 2004年“合成生物學(xué)”被美國MIT出版的Technology Review評為將改變世界的10大新出現(xiàn)的技術(shù)之一。例如有學(xué)者利用基因表達(dá)調(diào)控元件構(gòu)成了生物邏輯門、振蕩器、反饋回路等組件。有學(xué)者根據(jù)細(xì)胞外部或內(nèi)部某些特定參數(shù)的變化來控制細(xì)胞的生長、分化和代謝等生命活動的設(shè)計實現(xiàn)了非天然的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。You等設(shè)計的對菌體密度敏感的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)能導(dǎo)致細(xì)菌死亡,從而實現(xiàn)對大腸桿菌生長密度的調(diào)控。麻省理工學(xué)院的研究人員獲得了能對不同光照條件做出應(yīng)答的大腸桿菌。利用代謝工程技術(shù)改造細(xì)胞代謝途徑來合成復(fù)雜化合物的方法,將大大降低藥品或者材料的生產(chǎn)成本,直接造福大眾。例如, Keasling等向大腸桿菌中導(dǎo)入了來自苦艾草、釀酒酵母等其他物種的10個基因,改造后的代謝系統(tǒng)表達(dá)出了能治療瘧疾的青蒿素等類萜類化合物。 相對于國外對合成生物學(xué)的重視程度,國內(nèi)的合成生物學(xué)的發(fā)展才剛剛起步，中國科學(xué)院合成生物學(xué)重點(diǎn)實驗室于2009年2月2日正式獲批在上海成立，國內(nèi)在該領(lǐng)域還沒有相關(guān)研究成果的報道，從國內(nèi)中文期刊數(shù)據(jù)庫以“ 合成生物學(xué)”為關(guān)鍵詞只有幾篇綜述短文。合成生物學(xué)有巨大的理論研究價值和實際應(yīng)用價值,其試驗成果將會產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益,具有廣闊的應(yīng)用前景。 本發(fā)明利用合成生物學(xué)的方法，在大腸桿菌中構(gòu)造一個穩(wěn)定、可控的“基因計時開關(guān)”，通過本發(fā)明設(shè)計，基因生物計時開關(guān)可以對大腸桿菌外的L-阿拉伯糖分子濃度信號做出響應(yīng)，從而實現(xiàn)對計時開關(guān)的定時控制。這一發(fā)明可以調(diào)控大腸桿菌在某一特定時段內(nèi)表達(dá)特定目的蛋白，不僅可以用于對瞬時表達(dá)蛋白質(zhì)的功能研究，也在工業(yè)發(fā)酵中利用大腸桿菌對外界調(diào)控因素的響應(yīng)實現(xiàn)精密的自我調(diào)控。
