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基本信息
- 項目名稱：
- 運(yùn)用BALB/C小鼠肝癌逐級轉(zhuǎn)移模型評價復(fù)方苦參注射液療效
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 研究內(nèi)容：建立建立BALB/C小鼠分級轉(zhuǎn)移肝癌模型與復(fù)方苦參注射液療效分析。通過篩選具有持續(xù)增殖能力的腫瘤干細(xì)胞。以transwell實(shí)驗(yàn)挑選具有遷移能力差異的細(xì)胞亞株。通過原位植入肝癌細(xì)胞的小鼠，進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的分離。原代分離及培養(yǎng)，腫瘤侵潤原位肝癌組織、淋巴結(jié)、肺部轉(zhuǎn)移灶、腹水。再次植入小鼠并重復(fù)4次，以達(dá)到分離轉(zhuǎn)移分化的目的。最后選出最大差異的兩亞株進(jìn)行苦參注射液的療效評價。
- 詳細(xì)介紹：
- 工作方案： 1.從廣州中醫(yī)藥大學(xué)腫瘤實(shí)驗(yàn)室獲得BALB/C小鼠H22肝癌細(xì)胞系。在無菌條件下，快速解凍，一般培養(yǎng)基+小牛血清混合液稀釋，并提取單細(xì)胞，數(shù)量為100個。 2.將10個腫瘤細(xì)胞放入同一培養(yǎng)管中。培養(yǎng)管經(jīng)行固態(tài)培養(yǎng)基覆蓋預(yù)處理。 3.待細(xì)胞增殖至形成“細(xì)胞群”時，分離挑取獨(dú)立細(xì)胞群，再次培養(yǎng)增殖，直至細(xì)胞數(shù)量約2*10^7時，停止培養(yǎng)，細(xì)胞亞株標(biāo)號。 3.1若集合癌細(xì)胞所生成的生長刺激因子濃度不夠，目標(biāo)細(xì)胞不增殖分裂，則將集合癌細(xì)胞快速生長期的培養(yǎng)液混合清潔小牛血清+培養(yǎng)基以1/2比例配成混合液，再培養(yǎng)細(xì)胞亞株。 4.保存細(xì)胞樣品，MTT法計數(shù)，定量細(xì)胞為10^6/ml。 5.分離、過濾腫瘤細(xì)胞株，做transwell實(shí)驗(yàn)： 6.取出現(xiàn)遷移的次序?yàn)榈谝唬詈蟮募?xì)胞亞株解凍，培養(yǎng)，分別標(biāo)號為HL組。 7. 分離、過濾濃縮細(xì)胞至10^7/ml,備用。 8．普通級BALB/C小鼠表面，注射H22細(xì)胞亞株HL組于左肝葉，每組8只。 9.抗生素預(yù)防感染處理3天。 10．過程只觀察毛色，食量，飲水量，活動等。 11.5周后殺鼠 11.1頸脫臼處死小鼠，泡入75%的酒精消毒，移入超凈工作臺。 11.2腹部剪開皮膚，并剝皮。 11.3取腹水、肝原位腫瘤、周圍淋巴結(jié)（特別是腫大淋巴結(jié)）、肺組織。 11.4用等濃度分離法分離腹水細(xì)胞，抽取癌細(xì)胞，再培養(yǎng)，標(biāo)號。 11.5取腫大淋巴結(jié)原代培養(yǎng)，標(biāo)號。 11.6對肝原位腫瘤、周圍淋巴結(jié)、肺，做石蠟切片，計數(shù)癌細(xì)胞侵潤，分級。 11.6．1以《從基因組學(xué)到蛋白組學(xué)肝癌轉(zhuǎn)移分子機(jī)理的研究及臨床應(yīng)用》中評級標(biāo)準(zhǔn)為參照標(biāo)準(zhǔn)。預(yù)實(shí)驗(yàn)1次以獲得正確的殺鼠時間點(diǎn)。 12．取評級次序?yàn)榈谝?，最后的?xì)胞亞株再次種植到下一批次小鼠肝臟。（重復(fù)7-11步，重復(fù)3次）。共耗時約20周。共用鼠2組*每組4只*3批次=24只。 13.至最后一批次取評級次序?yàn)榈谝?，最后的?xì)胞亞株，分離原代培養(yǎng)腹水癌細(xì)胞，原代種植到第4批次小鼠（HL組*高中低*每組4只=48只），經(jīng)過2周，造模結(jié)束。 14.從第4批次小鼠種植癌細(xì)胞的第2周開始給腹腔注射給藥，連續(xù)注射21天。 15.殺鼠，取腹水、肝原位腫瘤、周圍淋巴結(jié)（特別是腫大淋巴結(jié)）、肺、胸腺、脾組織。 16.對肝原位腫瘤、周圍淋巴結(jié)、肺，做石蠟切片，計數(shù)癌細(xì)胞侵潤，分級。腹水總癌細(xì)胞計數(shù)。 17.數(shù)據(jù)統(tǒng)計，分析。統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)用x ± s 表示, 采用SPSS11 .0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析, 檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0 . 05。 18.論文寫作
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的 觀察腫瘤在免疫壓力下轉(zhuǎn)移的分化，建立具有健全免疫的腫瘤分級轉(zhuǎn)移模型，為進(jìn)一步研究免疫壓力在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程的分子演化中的作用奠定了基礎(chǔ)。 基本思路 目前抗腫瘤的方法，除了手術(shù)切除，大部分治療方式都有強(qiáng)烈的致畸作用，因此在抗腫瘤治療的過程中會不斷產(chǎn)生新的致癌因子，改變腫瘤的生物行為性質(zhì)。因此基于健全免疫的分級轉(zhuǎn)移模型，通過腫瘤轉(zhuǎn)移的行為篩選合適的抗腫瘤藥物，就能指導(dǎo)臨床抗腫瘤藥物的使用。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 本文選擇具有健全免疫系統(tǒng)的BALB/C小鼠作為模型，其目的是為了觀察在自然狀態(tài)下腫瘤在免疫壓力下的轉(zhuǎn)移傾向，貼近臨床實(shí)際。 本文以建立逐級轉(zhuǎn)移非裸鼠肝癌轉(zhuǎn)移模型為集成創(chuàng)新，并以此建立以轉(zhuǎn)移分化差異的研究平臺及藥物試驗(yàn)平臺，可為臨床藥物使用提出指導(dǎo)性意見。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實(shí)意義
- 建立肝癌同種異體移植，分級轉(zhuǎn)移模型，建立以非裸鼠，且具有免疫力的體內(nèi)逐級轉(zhuǎn)移模型。為進(jìn)一步研究免疫壓力在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程的分子演化中的作用奠定了基礎(chǔ)。指導(dǎo)臨床的藥物應(yīng)用。 改變實(shí)驗(yàn)方法，其一，觀察腫瘤細(xì)胞在同種小鼠免疫健全的狀態(tài)下腫瘤侵潤的趨勢；其二，減少由手術(shù)應(yīng)激引起的對小鼠機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)等的影響。 改良細(xì)胞培養(yǎng)增殖單細(xì)胞方法，降低實(shí)驗(yàn)成本，并達(dá)到增殖單個腫瘤細(xì)胞的目的。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 無
獲獎情況
- 無
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻(xiàn)
- 【參考文獻(xiàn)】 1. 湯釗猷 李雁 轉(zhuǎn)移性人肝癌模型系統(tǒng)建立及肝癌轉(zhuǎn)移研究應(yīng)用 醫(yī)學(xué)研究雜志 2007-10； 36 （10） 2. 萬方軍 蔡健華 趙任 體內(nèi)連續(xù)篩選法建立人結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移階梯細(xì)胞模型 《外科理論與實(shí)踐》2009；14（6）：633-638 3. 楊敏 楊朝暉 侯致典 李學(xué)農(nóng) 體內(nèi)連續(xù)篩選法建立可視化乳腺癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型 《南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》2008；28（6）：944-947 4. 張玉俠 朱秀 王金萍 體內(nèi)外連續(xù)篩選建立人前列腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞系及其生物學(xué)特性《安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》2009-4；44（2）：173-176 5. 脫朝偉 劉秋珍 張寧 楊波 王明耀 體內(nèi)連續(xù)篩選法建立人原發(fā)性小腸惡性淋巴瘤裸鼠原位移植肝轉(zhuǎn)移模型《解放軍醫(yī)學(xué)雜志》2007-9；32（9）：926-929 6. 李雁 湯釗猷 葉勝龍 劉銀坤 陳潔 體內(nèi)連續(xù)篩選法建立自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系《中華醫(yī)學(xué)雜志》2002-5-10；82（9）：601-605 7. 湯釗猷 高轉(zhuǎn)移人肝癌裸鼠模型和細(xì)胞系的建立、研究與應(yīng)用醫(yī)學(xué)研究通訊2003；32（9）：16-17 8. 韓克起, 顧偉 小鼠肝癌原位移植模型的建立及生物學(xué)特性 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報2004 -9 ；2（5 ）： 372-374 9．張萌，胡少為，姜桔紅，文劍明 梯度密度離心法分離肝癌細(xì)胞及其轉(zhuǎn)移性細(xì)胞株的建立 2007-11；28（6）：670-671 10. 代志軍 高潔 復(fù)方苦參注射液對胃癌SGC-7901細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響 中藥材2007-7；30（7）：815-819 11. 葉正青 梁重峰 復(fù)方苦參注射液對人肝癌SMMC-7721腫瘤細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究 山東醫(yī)藥 2009； 49(16) ：44-45 12. 李芮 杜健鵬 侯仰韶 復(fù)方苦參注射液對SGC-7901,HepG2和BEL-7402腫瘤細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究 腫瘤研究與臨床 2006 ；18(1) ：8-10 13. 林麗珠 周岱翰 復(fù)方苦參注射液對肺癌和肝癌細(xì)胞抑瘤作用研究中藥新藥與臨床藥理2009-1； 20（1）：21-23
同類課題研究水平概述
- 同類研究： 一、模型的建立 目前這種體內(nèi)連續(xù)篩選法建立腫瘤模型都是以裸鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停哂谢驅(qū)W的明顯優(yōu)勢。該模型系統(tǒng)的裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移特點(diǎn)表明，隨著特定器官轉(zhuǎn)移篩選次數(shù)的增加，瘤細(xì)胞對該器官的定向轉(zhuǎn)移能力逐漸增強(qiáng)，同時也出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移方向的泛化趨勢，這是一個自發(fā)性轉(zhuǎn)移力由弱到強(qiáng)、由單向轉(zhuǎn)移到多向轉(zhuǎn)移的動態(tài)模型系統(tǒng)，有非常明顯的表型差異，有利于探索其背后的分子機(jī)制?！?】 已經(jīng)建立的模型種類有人結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移【2】，可視化乳腺癌肝轉(zhuǎn)移【3】，人前列腺癌高轉(zhuǎn)移【4】，人原發(fā)性小腸淋巴瘤裸鼠原位移植肝轉(zhuǎn)移模型【5】，自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移人肝癌模型篇【6】。雖然裸鼠實(shí)驗(yàn)的在理論上具有的優(yōu)勢相當(dāng)明顯，但是實(shí)驗(yàn)條件比較高，需要無菌環(huán)境或SPF。 基礎(chǔ)的理論方法是湯釗猷【6】最早提出，體內(nèi)連續(xù)篩選法，并建立了LCI．D20【7】，MHCC97，MHCC97-L等不同的轉(zhuǎn)移模型。 基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)方法參考韓克起【8】的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，建立相關(guān)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，為本實(shí)驗(yàn)提供成本的相關(guān)信息。 實(shí)驗(yàn)所需的梯度密度離心法分離肝癌細(xì)胞是現(xiàn)實(shí)可行，容易操作的實(shí)驗(yàn)方法【9】。 二、復(fù)方苦參注射液的臨床價值 復(fù)方苦參注射液在臨床上已經(jīng)使用了10年余，是臨床上有效的抗腫瘤中成藥物，是具有中醫(yī)特色的治療手段，為拒絕放化療及手術(shù)治療的患者提供治療手段，學(xué)術(shù)文獻(xiàn)以臨床觀察為主，證明了復(fù)方苦參注射液在抗腫瘤治療上有廣泛的抗癌譜，聯(lián)合化療治療中晚期惡性腫瘤能減輕毒副反應(yīng)、提高近期療效和患者生存質(zhì)量。 但是由于臨床條件，苦參注射液的應(yīng)用主要是以常規(guī)化療為基礎(chǔ)，以輔助用藥的角色在臨床上應(yīng)用，未能體現(xiàn)出苦參注射液單藥對腫瘤實(shí)體作用，因此單藥臨床藥物研究的文獻(xiàn)相對較少。 復(fù)方苦參注射液在細(xì)胞組織學(xué)方面的研究相對較少，但是也是復(fù)方苦參注射液單藥對腫瘤細(xì)胞的作用研究相對集中的領(lǐng)域，現(xiàn)已證明了復(fù)方苦參注射液對胃癌SGC-7901【10】，人肝癌SMMC-7721【11】有促調(diào)亡和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。同時復(fù)方苦參注射液也對HepG2和BEL-7402【12】，肺癌LAC、Lewis細(xì)胞,肝癌Hep、H22腫瘤細(xì)胞均有體內(nèi)、外的抑瘤效果【13】。 利用體內(nèi)連續(xù)篩選法是一個較為新型的腫瘤模型，對腫瘤的病理發(fā)展具有理論的優(yōu)勢，明確了腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在能力，為抗腫瘤藥物干預(yù)存在轉(zhuǎn)移潛能差異的細(xì)胞提供一個平臺。
