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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 人TSHβ新剪接變體重組蛋白的表達(dá)
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 通過(guò)對(duì)TSHα鏈和TSHβ新剪接變體的研究，有助于更加深入的了解下丘腦-垂體-甲狀腺免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)。從一個(gè)新的角度來(lái)了解人類自身免疫性甲狀腺疾病。研究空間及內(nèi)分泌學(xué)意義較大。
- 詳細(xì)介紹：
- 下丘腦-垂體-甲狀腺軸（HPT軸）是一個(gè)綜合性調(diào)節(jié)荷爾蒙分泌的網(wǎng)絡(luò)，對(duì)于維持代謝活動(dòng)的必不可少的。TSH（促甲狀腺激素）是垂體分泌的促進(jìn)甲狀腺的生長(zhǎng)和機(jī)能的激素。近期發(fā)現(xiàn)在人的外周血白細(xì)胞、垂體和甲狀腺中存在一個(gè)新的TSHβ剪接變體，其生物學(xué)作用目前尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)TSHβ新剪接變體基因和TSHα基因進(jìn)行克隆，利用CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)獲取重組蛋白并進(jìn)行鑒定，以便對(duì)TSHβ新剪接變體存在的生物學(xué)意義進(jìn)行深入研究。
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作品專業(yè)信息
撰寫(xiě)目的和基本思路
- 將克隆得到人TSHβ新剪接變體基因，TSHα基因，利用CHO表達(dá)系統(tǒng)獲得TSHβ新剪接變體基因蛋白和TSHα基因蛋白，并將嘗試驗(yàn)證TSHβ新剪接變體與TSHα能否形成的二聚體。 利用RT-PCR方法，從人外周血白細(xì)胞和胎盤(pán)分別獲得TSHβ新剪接變體基因和TSHα基因，采用質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定后，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞，抗生素加壓篩選，得到蛋白并進(jìn)行鑒定。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 人類TSH為一種糖蛋白，含211個(gè)氨基酸，糖類約占整個(gè)分子的15％。整個(gè)分子由兩條肽鏈—α鏈和β鏈組成。2009年Vincent等報(bào)告小鼠骨髓細(xì)胞表達(dá)一新TSHβ剪接變體，是由84個(gè)氨基酸組成的多肽。TSHβ新剪接變體基因在CHO細(xì)胞中表達(dá)的分泌蛋白，分子量為8kDa，初步檢測(cè)有生物活性。課題新穎獨(dú)特，屬于下丘腦－垂體－甲狀腺－免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)中的未知領(lǐng)域。研究空間及內(nèi)分泌學(xué)意義較大。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 通過(guò)對(duì)TSHɑ基因鏈和TSHβ新剪接變體的研究，有助于更加深入的了解下丘腦－垂體－甲狀腺－免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)TSHɑ基因剪接體，TSHβ新剪接變體，及二者的結(jié)合體的生物學(xué)活性研究具有重要意義。 本課題的研究有助于了解及研究免疫系統(tǒng)細(xì)胞，T細(xì)胞,B細(xì)胞,脾樹(shù)突狀細(xì)胞,骨髓造血細(xì)胞,腸粘膜上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等對(duì)生成TSH的機(jī)制和功能意義，并從一個(gè)新的角度來(lái)了解人類自身免疫性甲狀腺疾病。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 目的：我們通過(guò)本實(shí)驗(yàn)將克隆得到人TSHβ新剪接變體基因，TSHα基因，利用CHO表達(dá)系統(tǒng)獲得TSHβ新剪接變體基因蛋白和TSHα基因蛋白，并將嘗試驗(yàn)證TSHβ新剪接變體與TSHɑ能否形成的二聚體。方法：利用RT-PCR方法，從人外周血白細(xì)胞和胎盤(pán)分別獲得TSHβ新剪接變體基因和TSHα基因，采用質(zhì)粒構(gòu)建，成功構(gòu)建表達(dá)載體 pSELECT-GFP zeo-TSHβ和pcDNATM3.1D/V5-His-TOPO；經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定后，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞，抗生素加壓篩選，得到蛋白并進(jìn)行鑒定。結(jié)果：得到了人TSHβ新剪接變體基因和TSHα基因，測(cè)序結(jié)果正確；成功構(gòu)建了表達(dá)載體并得到穩(wěn)定表達(dá)TSHβ新剪接變體蛋白和TSHα基因蛋白的CHO 細(xì)胞株， 利用TSHβ抗體與TSHα抗體進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，結(jié)果顯示人TSHβ新剪接變體蛋白約為8KDa，TSHα成熟蛋白約為20 KDa。結(jié)論：成功克隆TSHβ新剪接變體基因和TSHα基因，獲得TSHβ新剪接變體和TSHα的重組蛋白，為深入研究TSHβ新剪接變體生物學(xué)特性提供了必要條件。
獲獎(jiǎng)情況
- 無(wú)
鑒定結(jié)果
- 無(wú)
參考文獻(xiàn)
- [1]JOHN R. KLEIN, et al. The Immune System as a Regulator of Thyroid Hormone Activity[J]. Department of Diagnostic Sciences, Dental Branch, University of Texas Health Science Center, Houston, TX 77030 [2]Jeremy S, Schaeferand John R, Klein, et al. Immunological regulation of metabolism- a novel Quintessential role for the immune system in health and disease[J]. The FASEB Journal. 2011, 25: 29-34.
同類課題研究水平概述
- 早在幾十年前人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)能直接和間接地影響免疫系統(tǒng)的發(fā)育和功能的活性。 人類和小鼠TSHβ亞單位由138 氨基酸組成，含有20個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，成熟甲狀腺激素β亞單位蛋白為118個(gè)氨基酸。人TSHβ基因由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，編碼區(qū)由位于外顯子2和3的部分組成。小鼠的TSHβ基因由5個(gè)外顯子組成，編碼區(qū)由位于外顯子4和5的部分組成。從人垂體分離的hTSHβ只有112個(gè)氨基酸，是由于C端的6個(gè)氨基酸被去掉所致。α亞單位的生成與分泌總比β亞單位多，所以α亞單位與β亞單位結(jié)合成TSH后，血中一般測(cè)不出殘留的β亞單位，但可以測(cè)得α亞單位[1]。 20年前Smith等人首次證實(shí)了免疫系統(tǒng)細(xì)胞可以產(chǎn)生TSH，隨后相繼發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞，B細(xì)胞，脾樹(shù)突狀細(xì)胞，骨髓造血細(xì)胞，腸粘膜上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞都可以產(chǎn)生TSH。在次級(jí)淋巴組織，脾樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)是TSH的重要來(lái)源[2]。但到目前為止這些細(xì)胞生成TSH的機(jī)制和功能意義還不十分清楚。 最近的研究表明，目前免疫系統(tǒng)中的TSH，存在著一種TSHβ新剪接變體。這種剪接變異體優(yōu)先由免疫系統(tǒng)細(xì)胞生成，并通過(guò)一些造血細(xì)胞遷移至甲狀腺[3]。 2009年Vincent等報(bào)告小鼠骨髓細(xì)胞表達(dá)一TSHβ新剪接變體，是由84個(gè)氨基酸組成的多肽，含有9個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，有意思的是它只是原始的成熟的TSHβ分子的71.2%[4]。TSHβ新剪接變體是由TSHβ基因第4內(nèi)含子的一部分和第5外顯子編碼而成，缺失外顯子4。自然的TSHβ在垂體中高表達(dá)[5]，而TSHβ新剪接變體在骨髓和甲狀腺中高表達(dá)，在垂體中表達(dá)較低。TSHβ新剪接體基因在CHO細(xì)胞中表達(dá)的分泌蛋白，分子量為8kDa，初步檢測(cè)有生物活性。TSHβ新剪接變體在FRTL-5甲狀腺濾泡細(xì)胞和鼠的肺巨噬細(xì)胞引起cAMP反應(yīng)，TSHβ誘導(dǎo)cAMP反應(yīng)的峰活性濃度是10-10mol, TSHβ新剪接變體誘導(dǎo)cAMP反應(yīng)的峰活性濃度是 10-6mol。在系統(tǒng)性病毒感染以后，TSHβ新剪接變體在甲狀腺中的表達(dá)顯著上調(diào)而自然的TSHβ在甲狀腺中并沒(méi)有顯著上調(diào)[6]。推測(cè)這個(gè)新發(fā)現(xiàn)的TSHβ新剪接變體可能在下丘腦-垂體-甲狀腺-免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)中起重要作用。
