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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- RNAi載體的構(gòu)建及其對(duì)擬南芥植株的轉(zhuǎn)化
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- RNAi已成為特異消除靶基因表達(dá)的一項(xiàng)有力技術(shù). pFGC5941是RNAi技術(shù)專用載體，該載體攜帶兩段反向的目的基因，在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄出的RNA可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)hairpin，形成局部的dsRNA, 在Dicer 酶的作用下結(jié)合到與該dsRNA 具有同源性的mRNA 上, 而把mRNA 剪切降解,造成目的基因的沉默，從而研究植物在缺鐵環(huán)境下目的基因的功能。
- 詳細(xì)介紹：
- RNAi指轉(zhuǎn)化入細(xì)胞的雙鏈RNA消除或降低靶基因的表達(dá)能力的機(jī)制.與雙鏈RNA互補(bǔ)的DNA序列引起靶基因的mRNA降解,從而引起基因沉默現(xiàn)象.我們采用遠(yuǎn)紅外熱成像技術(shù)篩選得到逆境脅迫敏感擬南芥突變體F246，為了進(jìn)一步分析F246突變基因的功能，采用RNAi基因沉默技術(shù)，RT－PCR技術(shù)擴(kuò)增得到F246基因編碼序列，構(gòu)建含有F246特異序列的pFGC5941－246載體；采用農(nóng)桿菌浸花法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因植株，希望依此分析F246基因的功能。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：本實(shí)驗(yàn)采用遠(yuǎn)紅外熱成像技術(shù)篩選得到逆境脅迫敏感擬南芥突變體F246，為了進(jìn)一步分析F246突變基因的功能，采用RNAi基因沉默技術(shù)，RT－PCR技術(shù)擴(kuò)增得到F246基因編碼序列，構(gòu)建含有F246特異序列的pFGC5941－246載體；采用農(nóng)桿菌浸花法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因植株，希望依此分析F246基因的功能
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 由于RNAi技術(shù)可以利用siRNA或siRNA表達(dá)載體快速、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的以序列特異方式剔除目的基因表達(dá)，所以現(xiàn)在已經(jīng)成為探索基因功能的重要研究手段。在傳染性疾病和惡性腫瘤基因治療領(lǐng)域發(fā)展極為迅速。RNAi在整形外科領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景，在病毒性疾?。ɡ绨滩。?、遺傳性疾病、腫瘤病的治療上開辟了新的領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)則利用了RNAi載體對(duì)擬南芥的進(jìn)行基因敲出，研究F246目的基因在缺鐵情況下的功能。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- RNAi已成為特異消除靶基因表達(dá)的一項(xiàng)有力技術(shù). pFGC5941是RNAi技術(shù)專用載體，該載體攜帶兩段反向的目的基因，在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄出的RNA可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)hairpin，形成局部的dsRNA, 在Dicer 酶的作用下結(jié)合到與該dsRNA 具有同源性的mRNA 上, 而把mRNA 剪切降解,造成目的基因的沉默，從而研究植物在缺鐵環(huán)境下目的基因的功能。
學(xué)術(shù)論文摘要
- RNAi指轉(zhuǎn)化入細(xì)胞的雙鏈RNA消除或降低靶基因的表達(dá)能力的機(jī)制.與雙鏈RNA互補(bǔ)的DNA序列引起靶基因的mRNA降解,從而引起基因沉默現(xiàn)象. RNAi已成為特異消除靶基因表達(dá)的一項(xiàng)有力技術(shù). pFGC5941是RNAi技術(shù)專用載體，該載體攜帶兩段反向的目的基因，在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄出的RNA可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)hairpin，形成局部的dsRNA, 在Dicer 酶的作用下結(jié)合到與該dsRNA 具有同源性的mRNA 上, 而把mRNA 剪切降解,造成目的基因的沉默，從而研究植物在缺鐵環(huán)境下目的基因的功能。我們采用遠(yuǎn)紅外熱成像技術(shù)篩選得到逆境脅迫敏感擬南芥突變體F246，為了進(jìn)一步分析F246突變基因的功能，采用RNAi基因沉默技術(shù)，RT－PCR技術(shù)擴(kuò)增得到F246基因編碼序列，構(gòu)建含有F246特異序列的pFGC5941－246載體；采用農(nóng)桿菌浸花法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因植株，希望依此分析F246基因的功能。
獲獎(jiǎng)情況
- 無(wú)
鑒定結(jié)果
- 基本屬實(shí)
參考文獻(xiàn)
- 參考文獻(xiàn)： [1] 種 康,許智宏，王雷. 植物功能基因組學(xué)研究的有效工具———RNAi 技術(shù)[J]. 植物生理學(xué)通訊, 2003, 39(6): 705-710. [2] 徐秉良，師 桂，王延秀.RNA干擾與基因敲除[J].生物技術(shù)通訊，2004,15（15）:386-388. [3] 曹艷紅，章 鎮(zhèn)， 姚泉洪，等.蘋果多酚氧化酶雙鏈RNA干擾(RNAi)研究[J].實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào),2004,37(6):487-493. [4] 朱龍付，張獻(xiàn)龍.RNAi及其在植物遺傳改良中的應(yīng)用[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,23(4):472-477. [5] 楊小二，孔 華， 郭安平，等.RNAi 技術(shù)及其在植物分子生物學(xué)中的應(yīng)用[J].分子植物育種, 2005, 3(4): 571-574. [6] 黃冰艷，吉萬(wàn)全，郭藹光，等.轉(zhuǎn)錄后基因沉默( PTGS) 及其在作物遺傳改良中的應(yīng)用[J].中國(guó)生物工程雜志,2005, 25(5):1-5. [7] 哀建國(guó)，楊 勇.RNA介導(dǎo)的植物基因沉默作用及其應(yīng)用[J].浙江林學(xué)院學(xué)報(bào),2005,22(1):123-128. [8] Benjamin Lewin Genes[M].第8版. 科學(xué)出版社,2005:365-367. [9] 薩姆布魯克 J, 弗里奇E F ,曼尼阿蒂斯 T. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].第2版.科學(xué)出版社,1999:1-26, 304-325.
同類課題研究水平概述
- RNAi作為一種高效的序列特異性基因剔除技術(shù)在傳染性疾病和惡性腫瘤基因治療領(lǐng)域發(fā)展極為迅速。RNAi在整形外科領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景，在病毒性疾?。ɡ绨滩。?、遺傳性疾病、腫瘤病的治療上開辟了新的領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)則利用了RNAi載體對(duì)擬南芥的進(jìn)行基因敲出，研究F246目的基因在缺鐵情況下的功能。 RNAi的發(fā)現(xiàn) 早在1990 年進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物有關(guān)研究時(shí)偶然發(fā)現(xiàn),將全長(zhǎng)或部分基因?qū)胫参锛?xì)胞后某些內(nèi)源性基因不能表達(dá),但這些基因的轉(zhuǎn)錄并無(wú)任何影響,并將這種現(xiàn)象稱為基因轉(zhuǎn)錄后沉默. 1996 年在脈孢菌屬中發(fā)現(xiàn)了相似現(xiàn)象,只不過(guò)將這種現(xiàn)象命名為基因表達(dá)的阻抑作用. 首次發(fā)現(xiàn)dsRNA 能夠?qū)е禄虺聊木€索來(lái)源于線蟲Caenorhabditis elegans 的研究。1995年康乃爾大學(xué)的研究人員嘗試用反義RNA 去阻斷par－1 基因的表達(dá)以探討該基因的功能,結(jié)果反義RNA 的確能夠阻斷par21基因的表達(dá),但是奇怪的是,注入正義鏈RNA 作為對(duì)照,也同樣阻斷了基因的表達(dá)。這個(gè)奇怪的現(xiàn)象直到3年后才被解開——華盛頓卡耐基研究院的Andrew Fire 和馬薩諸塞大學(xué)癌癥中心的Craig Mello 首次將雙鏈dsRNA ——正義鏈和反義鏈的混合物注入線蟲,結(jié)果誘發(fā)了比單獨(dú)注射正義鏈或者反義鏈都要強(qiáng)得多的基因沉默。實(shí)際上每個(gè)細(xì)胞只要很少幾個(gè)分子的雙鏈RNA 已經(jīng)足夠完全阻斷同源基因的表達(dá)。后來(lái)的實(shí)驗(yàn)表明在線蟲中注入雙鏈RNA 不單可以阻斷整個(gè)線蟲的同源基因表達(dá),還會(huì)導(dǎo)致其第一代子代的同源基因沉默。他們將這種現(xiàn)象稱為RNA 干擾。
