基本信息
- 項目名稱：
- 類牛源抗菌肽NK-16多重原核表達及活性檢測
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術論文
- 簡介：
- 以牛的抗菌肽（Indolicidin）序列為模板，設計出具有抗菌活性新型抗菌肽NK-16。根據(jù)氨基酸序列和E.coli偏愛密碼子，反向翻譯設計并合成四段堿基序列。利用Overlapping PCR技術，獲得三串聯(lián)目的基因并成功克隆入pET 30a(+)載體中。經ITPG誘導獲得大量表達，目的蛋白純化酶切后仍具有抗菌活性。
- 詳細介紹：
- 本試驗在Indolicidin的氨基酸序列基礎上，進行了蛋白酶切位點的篩選，重新設計新的抗菌肽NK-16人工合成經鑒定仍具有抗菌活性。根據(jù)NK-16的氨基酸序列選用大腸桿菌的偏好密碼子，通過反向翻譯設計合成了四段NK-16的基因片段，利用Overlapping-PCR技術，獲得了目的基因片段。雙酶切后成功克隆到表達載體pET-30a(+)，經ITPG誘導得到目的蛋白，純化蛋白蛋酶切后獲得具有抗菌活性的目的多肽。為抗菌肽的原核低成本、高效表達奠定了基礎。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：通過基因工程手段大量獲得抗菌肽 思路：首先篩選出抗菌活性高、抗菌譜廣、分子量較小的抗菌肽，根據(jù)偏好密碼子，人工設計所需要的基因片段，然后構建表達載體，最后誘導表達純化，通過生物學手段鑒定出表達抗菌肽的抗菌活和抗譜。從而獲得具有活性的表達抗菌肽。
科學性、先進性及獨特之處
- 本文根據(jù)NCBI中的報道序列，人工設計合成新的抗菌肽NK-16基因，利用Over-laping PCR技術，獲得三段NK-16的重復基因序列。這種方法使抗菌肽通過蛋白酶切位點連接起來避免了抗菌肽本身對大腸桿菌的抑制和殺滅作用，同時可增加多肽的表達量，從而可降低試驗和生產成本。構建了NK-16基因的重組表達載體，轉化至大腸桿菌獲得了高效的表達，表達產物經純化酶切后仍具有抗菌活性。
應用價值和現(xiàn)實意義
- 作品通過基因工程技術在微生物中直接表達抗菌肽，由于抗菌肽分子小，而且表達產物可能對宿主有害，進而影響了基因的高水平表達。本論文解決了在抗菌肽生產過程中效率低、成本高等亟待解決的問題。
學術論文摘要
- 抗菌肽與傳統(tǒng)抗生素相比其抗菌性具有很大優(yōu)越性，特別的抗菌肽不產生耐藥性。但抗菌肽的來源一直是進行藥理研究和推廣應用難以突破的瓶頸。由于抗菌肽的分子小、含量低，直接從生物組織中提取、分離提純存在一定的困難。而化學合成成本高不易推廣應用?；蚬こ叹统蔀楂@得抗菌肽的主要手段。本文以牛的抗菌肽（Indolicidin）序列為模板，設計出具有抗菌活性新型抗菌肽NK-16。根據(jù)氨基酸序列和E.coli偏愛密碼子，反向翻譯設計并合成四段堿基序列。利用Overlapping PCR技術，獲得三串聯(lián)目的基因并成功克隆入pET 30a(+)載體中。經ITPG誘導獲得大量表達，目的蛋白純化酶切后仍具有抗菌活性，為抗菌肽的原核高效表達和進一步生產大量的抗菌肽樣品奠定了基礎。
獲獎情況
- 付登峰, 胡建和, 劉興友. 抗菌肽基因工程表達技術研究進展[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2010, 37(9): 124-126. Jianhe Hu, Minglu Xu, Bolin Hang, Lan Wang, Qing Wang, Junjie Chen, Tao Song, Dengfeng Fu, Ziliang Wang, Sanhu Wang, Xingyou Liu. Isolation and characterization of an antimicrobial peptide from bovine hemoglobin a-subunit.[J] World J Microbiol Biotechnol, 2011(27): 767–771. 付登峰, 胡建和, 劉興友. 動物源性抗菌肽抗菌機理的研究進展[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2010(5): 24-26
鑒定結果
- 情況屬實
參考文獻
- 進行抗菌肽研究的表達體系包括真核和原核表達體系兩種，其中在原核表達體系中大腸桿菌表達體系用的最多具有代表性，真核表達體系有小球藻表達體系、桿狀病毒介導的昆蟲表達系統(tǒng)、酵母表達體系，其中酵母表達體系用的最多可以說是真核表達體系的代表。 在過去的20年里，人們對大腸桿菌系統(tǒng)的遺傳學、生物化學和分子生物學方面有了充分的認識，使之成為表達許多外源蛋白質的首選表達系統(tǒng)。大腸桿菌遺傳圖譜明確、易培養(yǎng)、周期短、費用低，對許多蛋白質有較強的耐受能力，能較高水平地表達多種蛋白質。所以大腸桿菌是應用于DNA重組技術的主要宿主細菌。
同類課題研究水平概述
- 進行抗菌肽研究的表達體系包括真核和原核表達體系兩種，其中在原核表達體系中大腸桿菌表達體系用的最多具有代表性，真核表達體系有小球藻表達體系、桿狀病毒介導的昆蟲表達系統(tǒng)、酵母表達體系，其中酵母表達體系用的最多可以說是真核表達體系的代表。 在過去的20年里，人們對大腸桿菌系統(tǒng)的遺傳學、生物化學和分子生物學方面有了充分的認識，使之成為表達許多外源蛋白質的首選表達系統(tǒng)。大腸桿菌遺傳圖譜明確、易培養(yǎng)、周期短、費用低，對許多蛋白質有較強的耐受能力，能較高水平地表達多種蛋白質。所以大腸桿菌是應用于DNA重組技術的主要宿主細菌。李秀蘭等對天然抗菌肽CMIV的氨基酸序列作了50%的改動，根據(jù)E.coli偏愛的密碼子人工合成了肽基因片段，克隆到測序載體，再將此片段亞克隆至表達載體pET28上進行表達，融合蛋白經溴化氰裂解法（CNBr）裂解后，具有與天然抗菌肽相同的生物活性。2004年浙江大學的Peng等將人β-防御素2(hBD2)的基因插入到pET-32a(+)中構建融合表達載體，以大腸桿菌BL21為工程菌進行表達，純化后的蛋白具有抗菌活性，該研究表明應用基因工程技術可以大規(guī)模制備抗菌肽。Rao等采用串聯(lián)表達的方式在大腸桿菌中表達hPAB-β取得成功，在1～8個不同重復序列的串聯(lián)表達體系中，3個重復序列時蛋白產量最高，達到菌體總蛋白的27.8%，相當于(3.15±0.45)g/L濕菌。為了獲得大量fetidin，趙曉瑜等從蚯蚓(Eisenia fetida)中釣取fetidin的基因，分別克隆到pKW32和pMXB10中，構建了融合和非融合表達載體，并轉化大腸桿菌進行誘導表達。結果無論是融合還是非融合表達，產物均以包涵體形式存在。融合表達產物通過親和層析獲得復性，復性產物對粘質沙雷氏菌具有抗菌活性。說明有些抗菌肽在進行融合表達時，不影響抗菌肽的抗菌活性。為了驗證重組抗菌肽Ranalexin的抑菌活性，謝芳等提取牛蛙皮膚組織總RNA，經RT-PCR擴增抗菌肽基因ranalexin，克隆測序后，將該基因插入pGEX23X融合表達載體，進行原核表達，表達產物經復性純化后對金黃色葡萄球菌具有明顯的體外抑菌活性。綜合以上研究表明，原核表達是目前運用大腸桿菌進行的抗菌肽基因工程研究的主要方式。
