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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- PNRSV單克隆抗體及其ELISA檢測試劑盒的制備
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 大類：
- 科技發(fā)明制作A類
- 簡介：
- 我國對PNRSV的ELISA檢測均依賴于國外的抗血清。價格昂貴，檢測的成本非常高。該作品在制備了針對PNRSV的單克隆抗體的基礎(chǔ)上，開發(fā)了檢測田間植物中是否攜帶PNRSV的ELISA檢測試劑盒。試劑盒開發(fā)的技術(shù)含量高，但試劑盒使用時的技術(shù)含量低，對儀器設(shè)備要求低，適于推廣至鄉(xiāng)鎮(zhèn)級基層檢驗(yàn)檢疫部門的工作人員操作使用，應(yīng)用前景廣闊。
- 詳細(xì)介紹：
- 應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備了3株分泌針對李屬壞死環(huán)斑病毒（PNRSV）單抗的細(xì)胞株，分別命名為1D11、2G7和4H2。三種抗體均只與PNRSV發(fā)生反應(yīng)，不與近似種李屬矮縮病毒、蘋果莖痘病毒和蘋果褪綠葉斑病毒等的抗原發(fā)生交叉反應(yīng)，在檢測了單抗效價和檢測靈敏度的基礎(chǔ)上，建立了1D11稀釋10000倍，酶標(biāo)二抗稀釋5000倍，植物樣品的檢測濃度為50mg/mL的間接ELISA檢測系統(tǒng)用于田間樣品的檢測，并進(jìn)一步開發(fā)了試劑盒。該試劑盒的樣品檢測量大于400份。在此檢測系統(tǒng)下，能準(zhǔn)確檢測待檢植物樣品是否攜帶有PNRSV。
作品專業(yè)信息
設(shè)計(jì)、發(fā)明的目的和基本思路、創(chuàng)新點(diǎn)、技術(shù)關(guān)鍵和主要技術(shù)指標(biāo)
- 一、目的 制備基于單克隆抗體的能檢測出李屬壞死環(huán)斑病毒（PNRSV）的ELISA檢測試劑盒，幫助各出入境檢驗(yàn)檢疫局、基層植物保護(hù)站、植物檢疫站工作人員解決可以快速、準(zhǔn)確地鑒定近幾年新入侵我國的植物病毒PNRSV的難題。 二、基本思路 1. 應(yīng)用雜交瘤技術(shù)，通過動物免疫、細(xì)胞融合、細(xì)胞克隆化培養(yǎng)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測，篩選出能分泌針對PNRSV的單克隆抗體的細(xì)胞株； 2. 應(yīng)用ELISA檢測單克隆抗體的特異性明確該抗體的應(yīng)用前景； 3. 通過測定單克隆抗體的效價、檢測靈敏度以及樣品的稀釋倍數(shù)對檢測結(jié)果的影響，確定ELISA檢測的最佳工藝條件，開發(fā)出基于單克隆抗體并適于PNRSV檢測的ELISA試劑盒。 三、創(chuàng)新點(diǎn) 1．國內(nèi)首次制備出針對PNRSV的單克隆抗體； 2．國內(nèi)首次確定采用ELISA檢測田間發(fā)病植株的最佳工藝條件，并開發(fā)出檢測PNRSV的試劑盒。 四、技術(shù)關(guān)鍵 1．篩選出分泌針對PNRSV的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株； 2．制備PNRSV的ELISA檢測試劑盒。 五、主要技術(shù)指標(biāo) 利用該試劑盒能準(zhǔn)確鑒定出植物樣品中是否含有PNRSV。
科學(xué)性、先進(jìn)性
- 基于單克隆抗體的ELISA解決了多抗血清容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的問題，它將McAb與抗原的免疫反應(yīng)以及酶的高效催化反應(yīng)有機(jī)的結(jié)合在一起，具有檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)、儀器簡單、自動化程度高、檢測田間樣本多等特點(diǎn)。很好的解決了植物病毒很難用傳統(tǒng)的生物學(xué)方法和電鏡檢測法進(jìn)行鑒定的難題。此外，該方法的核心技術(shù)是要制備出高度特異性的McAb。這一部分工作的技術(shù)含量高，要求有專業(yè)實(shí)驗(yàn)室、先進(jìn)的儀器設(shè)備及經(jīng)驗(yàn)豐富的專業(yè)科研人員才能完成。一旦制備出了McAb，后期的ELISA檢測則具有操作簡單、設(shè)備要求少、易于推廣等特點(diǎn)。基層單位只要有恒溫培養(yǎng)箱、普通冰箱和微量移液槍或微量進(jìn)樣器等設(shè)備就具備該方法的實(shí)驗(yàn)條件。而基層農(nóng)技術(shù)人員則只需要按照ELISA檢測步驟把試劑逐步加入到酶標(biāo)板的反應(yīng)條中并按時洗滌更換反應(yīng)即可。試驗(yàn)的結(jié)果則根據(jù)反應(yīng)的顏色變化來判定，十分直觀。
獲獎情況及鑒定結(jié)果
- 無
作品所處階段
- 實(shí)驗(yàn)室階段
技術(shù)轉(zhuǎn)讓方式
- 技術(shù)入股
作品可展示的形式
- 實(shí)物、產(chǎn)品
使用說明,技術(shù)特點(diǎn)和優(yōu)勢,適應(yīng)范圍,推廣前景的技術(shù)性說明,市場分析,經(jīng)濟(jì)效益預(yù)測
- 利用基于單克隆抗體的ELISA檢測試劑盒具有檢測特異性高、成本低、時間短、檢測量大、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)濟(jì)效益十分明顯。 本試劑盒適于各出入境檢驗(yàn)檢疫局、植物保護(hù)站和植物檢疫站的基層工作人員使用，原因如下：（1）只要按照試劑盒說明書即能完成檢測；（2）基層工作單位具備恒溫培養(yǎng)箱、普通冰箱和微量移液槍等簡單的設(shè)備，（3）試劑盒提供全部試劑，能保證試劑盒的推廣應(yīng)用。 分子生物學(xué)方法的檢測成本為近10元/樣品，且檢測成本不隨樣品數(shù)增加而降低。應(yīng)用本試劑盒，前期細(xì)胞株的篩選成本約15000元，此后的檢測成本低于0.6元/樣品。由于細(xì)胞株篩選的成本是一定的，因此，檢測的數(shù)量越大，每一個樣品分?jǐn)偟某杀驹降?，只要檢測樣品總量達(dá)到3萬個，則每檢測一個樣品的全部成本約為1元。如果全國所有縣、市的植物保護(hù)站和植物檢疫機(jī)構(gòu)甚至是國外的相關(guān)機(jī)構(gòu)都采用該試劑盒，其樣品檢測的數(shù)量可達(dá)幾十萬個/年，經(jīng)濟(jì)效益可觀。
同類課題研究水平概述
- 1 國外的研究及發(fā)展 Valleau（1932）首次在李和桃樹上發(fā)現(xiàn)PNRSV造成的危害。目前，該病的發(fā)生已遍及歐洲、亞洲、非洲、南美和北美洲及大洋洲的40多個國家和地區(qū)。普遍危害歐洲大櫻桃、酸櫻桃、桃、蘋果、杏和洋李等李屬和薔薇屬植物，此外還侵染煙草、西瓜、菜豆、豌豆、草木樨、萵苣、向日葵等草木寄主。2002年Verma等又報(bào)道了新的寄主秋海棠。 據(jù)國外研究，該病毒侵染危害能力較強(qiáng)，幾乎可侵害所有的李屬植物，引起壞死，皺縮、花葉、環(huán)斑等，特別在苗期中發(fā)生會造成嚴(yán)重?fù)p失。被侵染的作物損失一般在10%-15%，嚴(yán)重時可達(dá)70% 。 國外對PNRSV的研究報(bào)道較多，除早期的發(fā)生與診斷外，檢測PNRSV的方法主要用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。采用分子生物學(xué)技術(shù)檢測PNRSV并對病毒基因組序列進(jìn)行測定也已成形，RT-PCR和IC-RT-PCR已應(yīng)用于PNRSV的檢測。 2 國內(nèi)的研究及發(fā)展 PNRSV是我國重點(diǎn)控制的對外檢疫性有害生物，中國學(xué)者近年來也開展了對PNRSV的研究。周媛月等在對陜西西安地區(qū)甜櫻桃園的調(diào)查中，首次報(bào)道了PNRSV在中國境內(nèi)的發(fā)生情況。山東、遼寧兩省也相繼檢測發(fā)現(xiàn)了PNRSV。李明福等（2005年）對北京懷柔地區(qū)部分核果類果園進(jìn)行疫情調(diào)查時，發(fā)現(xiàn)有PNRSV感染的情況，韓麗娟等（2007年）用分子生物學(xué)的方法首次鑒定了PNRSV對百合的侵染，證明了百合是PNRSV的一個新寄主。 PNRSV為核果類果樹的主要病毒，侵染核果類各種果樹，危害嚴(yán)重。這一病毒在我國甜櫻桃上感染率很高，且多與ApMV混合感染，造成嚴(yán)重的樹體衰弱和流膠。 PNRSV的檢疫方法有：生物學(xué)方法、電鏡檢測法、分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法。酶聯(lián)免疫吸咐（ELISA）法是病毒檢測的常用技術(shù)手段。ELISA檢測技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、安全、快速、一次可作大量樣品等優(yōu)點(diǎn)，非常適用果樹病毒的普查和快速檢測。目前我國對PNRSV的ELISA檢測均依賴于購買國外的抗血清。檢測效果好，但從國外進(jìn)口抗血清價格非常昂貴，導(dǎo)致檢測的成本非常高。因此，我國應(yīng)加強(qiáng)對核果類病毒抗體制備方面的研究。 本實(shí)驗(yàn)通過制備針對PNRSV的單克隆抗體，確定ELISA檢測的最佳工藝條件，并開發(fā)了檢測試劑盒，幫助我國快速準(zhǔn)確地鑒定進(jìn)境花卉攜帶的PNRSV。
