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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- MAP30基因畢赤酵母高效表達(dá)菌株的構(gòu)建及其表達(dá)產(chǎn)物的抗腫瘤活性研究
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 從苦瓜中克隆MAP30全長(zhǎng)基因，并將該基因連接至表達(dá)載體pPIC9k中，轉(zhuǎn)化GS115菌株，建立菌落PCR快速篩選方法，得到高效表達(dá)的重組畢赤酵母菌株，為重組MAP30蛋白藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
- 詳細(xì)介紹：
- 根據(jù)GeneBank公布的MAP30基因序列，設(shè)計(jì)了特異引物，并采用改良SDS法從苦瓜表皮中提取的基因組DNA，運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增出全長(zhǎng)861bp的MAP30基因。該基因經(jīng)酶切、連接，最后克隆至pPIC9K載體上。重組pPIC9k-MAP30質(zhì)粒經(jīng)Sac I酶切線性化后，采用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入GS115畢赤酵母細(xì)胞中，再經(jīng)G418篩選、菌落PCR鑒定，最終得到高拷貝重組畢赤酵母GS115菌株。重組菌株經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生目的MAP30蛋白，以SDS-PAGE和N-端測(cè)序等對(duì)所表達(dá)蛋白進(jìn)行分析鑒定，MTT法測(cè)定體外抗腫瘤活性。結(jié)果 基因測(cè)序表明，該基因已成功插入酵母表達(dá)載體pPIC9a-factor分泌信號(hào)下游，同源性分析表明該基因與GenBank（AF284811）的核苷酸同源性達(dá)99.9%，氨基酸同源性達(dá)100%。菌落PCR顯示外源基因已整合入酵母GS115菌株中。重組菌株在甲酵誘導(dǎo)下，經(jīng)SDS-PAGE分析可見表達(dá)的32kD特異性條帶，與預(yù)期相吻合，經(jīng)Lowry法分析表明目的蛋白表達(dá)量達(dá) 910 mg/L。初步的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)顯示，重組MAP30具有明顯的抑制胃癌細(xì)胞SGC7901的活性，IC50為 30ug/mL。N-端測(cè)序進(jìn)一步表明MAP30全長(zhǎng)蛋白在畢赤酵母中獲得了正確表達(dá)。結(jié)論 成功地克隆了MAP30全長(zhǎng)基因，構(gòu)建了含MAP30基因的重組畢赤酵母表達(dá)載體，并獲得了高效表達(dá)的重組畢赤酵母菌株，目的蛋白得到了正確的表達(dá)，且生物活性較高，為下一步研究開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：從苦瓜中克隆MAP30全長(zhǎng)基因，運(yùn)用畢赤酵母系統(tǒng)高效表達(dá)，并進(jìn)行初步抗腫瘤活性研究。 基本思路：根據(jù)GenBank公布的序列，設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增MAP30基因。該基因連接至pPIC9K上。用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入GS115細(xì)胞中，G418等篩選鑒定出高拷貝重組GS115菌株。經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，以SDS-PAGE等對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定，采用MTT法測(cè)定該蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞SCG7901株的抑制作用。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 從苦瓜中直接提取MAP30蛋白成本高、工藝復(fù)雜。但文獻(xiàn)中大多利用大腸桿菌表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物易形成包涵體，產(chǎn)物活性低、分離工藝復(fù)雜。運(yùn)用畢赤酵母表達(dá)MAP30蛋白尚未見報(bào)道。巴斯德畢赤酵母既具有分泌表達(dá)、表達(dá)量高、具有蛋白質(zhì)的加工、翻譯后修飾等功能。本研究建立了快速、簡(jiǎn)便的菌落PCR篩選方法，構(gòu)建出重組畢赤酵母高效表達(dá)菌株，誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)產(chǎn)量和活性也比較令人滿意，為進(jìn)一步抗腫瘤研究打下基礎(chǔ)。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 本研究運(yùn)用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了較高活性MAP30蛋白的表達(dá)，表達(dá)量為910mg/L。體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明，重組MAP30蛋白對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901具有明顯抑制作用，且呈劑量依賴性。MAP30可以特異地抑制受病毒感染的細(xì)胞和腫瘤轉(zhuǎn)化細(xì)胞，誘發(fā)其凋亡，但對(duì)正常細(xì)胞如T細(xì)胞、二倍體細(xì)胞和精細(xì)胞等卻沒有毒副作用，顯示了巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究為將MAP30蛋白開發(fā)成特異性抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 目的從苦瓜中克隆MAP30全長(zhǎng)基因，并將該基因連接至表達(dá)載體pPIC9k中，轉(zhuǎn)化GS115菌株，建立菌落PCR快速篩選方法，得到高效表達(dá)的重組畢赤酵母菌株，為重組MAP30蛋白藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。方法根據(jù)GeneBank公布的MAP30基因序列，設(shè)計(jì)引物，并以采用改良SDS法提取的基因組DNA，通過PCR技術(shù)，擴(kuò)增出全長(zhǎng)861bp的MAP30基因。該基因連接至pPIC9K載體上。采用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入GS115畢赤酵母細(xì)胞中，再經(jīng)MD、G418篩選以及菌落PCR鑒定，最終得到高拷貝重組畢赤酵母GS115菌株（GS115/pPIC9K-MAP30）。重組菌株經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，以SDS-PAGE、lowry法、N-端測(cè)序、MTT法等對(duì)所表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定與活性分析。結(jié)果該基因已成功插入酵母表達(dá)載體中。菌落PCR顯示外源基因已整合入酵母GS115菌株中。經(jīng)SDS-PAGE分析可見表達(dá)的32kD特異性條帶，與預(yù)期相吻合，經(jīng)測(cè)定蛋白表達(dá)量達(dá)910mg/L。初步的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)顯示，重組MAP30具有明顯的抑制胃癌細(xì)胞SGC7901的活性，IC50為30?g/mL。
獲獎(jiǎng)情況
- 作品于2010年4月在全國(guó)中文核心期刊《生物技術(shù)》雜志第20卷第2期發(fā)表
鑒定結(jié)果
- 真實(shí)，有一定的學(xué)術(shù)價(jià)值
參考文獻(xiàn)
- 2、鞠金秀，陳瑞莞，宋志宏. 苦瓜蛋白MAP30 研究進(jìn)展[J]. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2009 ，9（11）：1340-1342 3、林育泉，劉思，周鵬. 新型抗病毒抗腫瘤苦瓜蛋白MAP30的研究進(jìn)展[J].華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005,11（4）：24-29 4、林育泉，周鵬，曾召綿. 苦瓜MAP30蛋白基因克隆、表達(dá)及其抗腫瘤活性研究[ J ]. 中國(guó)生物工程雜志，2005，25（5）：60-66. 5、孟延發(fā), 孟雪琴, 張雪梅, 等. 苦瓜籽核糖體失活蛋白的基本性質(zhì)研究[ J ]. 蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2000，36(4): 80 6、Schreiber CA , Wan L , Sun Y , et al . The antiviral agents ，MAP30 and GAP31，are not toxic to human spermatozoa and maybe useful in preventing the sexual transmission of human immunodeficiency virus type 1[ J ] . Fertil Steril ，1999，72(4) ：686 - 690. 7、Bourinbaiar A S，Lee-Huang S. Potentiation of anti-HIV activity of anti-inflammatory drugs，dexamethasone and indomethacin, by MAP30, the antiviral agent from bitter melon. Biochem Biophys Res Commun，1995，208(2): 779
同類課題研究水平概述
- MAP30（momordica anti-HIV protein of 30 kD） 是從苦瓜（momordica charantia L）果實(shí)和種子中分離得到的單鏈核糖體失活蛋白。MAP30 基因沒有內(nèi)含子，全長(zhǎng) 861 bp，編碼 286 個(gè)氨基酸，理論相對(duì)分子質(zhì)量為 32 000。其 51～53 位的 Asn-Leu-Thr 是 N 連接糖基化位點(diǎn)。MAP30 具有抗病毒、抗腫瘤和抗微生物等多種生物學(xué)活性 , 尤其對(duì) HIV 有顯著的抑制作用，重組蛋白也具有與天然蛋白相同的功能和活性，MAP30 可以特異地抑制受病毒感染的細(xì)胞和腫瘤轉(zhuǎn)化細(xì)胞，誘導(dǎo)凋亡，但對(duì)正常細(xì)胞沒有毒副作用，因此具有巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值。 Rybak 等于 1994 年通過抗癌藥物篩選計(jì)劃首次發(fā)現(xiàn)MAP30 具有抗腫瘤細(xì)胞株的活性。Lee-Huang 等在體外用MAP30 處理 MDA-MB-231 人乳腺腫瘤細(xì)胞, 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的分化和 HER2 的分泌都受到抑制。將 MDA-MB-231 人乳腺腫瘤細(xì)胞植入 SCID 小鼠,在小鼠身上發(fā)展。成為廣泛轉(zhuǎn)移性腫瘤,所有小鼠在46 d內(nèi)死亡。給帶有人乳腺腫瘤細(xì)胞的 SCID 小鼠,每天一次10mg MAP30注射治療,連續(xù)10 d,能夠顯著提高小鼠的存活率,其中大約20%～25%的小鼠能夠在96 d內(nèi)帶瘤生存。其結(jié)果表明, MAP30 在體內(nèi)和體外都具有抗乳腺腫瘤細(xì)胞的活性。其他研究也證明, MAP30對(duì)多種病毒和腫瘤細(xì)胞有效,而對(duì)未感染的人正常細(xì)胞如T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單倍體細(xì)胞等均無(wú)毒性[5～9]。 從植物中直接提取MAP30蛋白成本高、工藝復(fù)雜，因此采用基因工程手段生產(chǎn)重組MAP30蛋白是一條有效途徑。在已報(bào)道的文獻(xiàn)是大多利用大腸桿菌表達(dá)，如莊東紅、林育泉等利用大腸桿菌成功地進(jìn)行了MAP30蛋白的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有一定的抑瘤活性。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)雖然操作方便，但是表達(dá)產(chǎn)物易形成無(wú)活性的包涵體，不利于分離純化。巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是利用甲醇作為唯一碳源，既具有原核表達(dá)系統(tǒng)良好的可操作性，又有真核表達(dá)系統(tǒng)的許多優(yōu)點(diǎn)，如蛋白質(zhì)的加工、翻譯后修飾等，該系統(tǒng)可進(jìn)行胞外分泌表達(dá)，表達(dá)量高，是外源基因理想的表達(dá)系統(tǒng)。
