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基本信息

項(xiàng)目名稱：
重金屬銅檢測(cè)生物傳感器的構(gòu)建及其初步應(yīng)用
小類：
能源化工
簡(jiǎn)介：
重金屬銅的檢測(cè)是評(píng)價(jià)環(huán)境污染的重要指標(biāo)之一，本項(xiàng)目通過基因敲除技術(shù)和基因融合技術(shù)成功構(gòu)建一株能特異、敏感檢測(cè)銅離子的微生物傳感器，為監(jiān)測(cè)影響到人類健康﹑食品安全的重金屬銅離子提供了一種簡(jiǎn)便、高效、高性價(jià)比的實(shí)施方案。
詳細(xì)介紹：
研究背景： 銅是機(jī)體必須的微量元素，但是過量的重金屬銅對(duì)于所有的生命體都是有毒的。人體內(nèi)過量的銅參與了很多疾病的發(fā)生和發(fā)展，比如印度兒童肝硬化， Tyrolean嬰兒慢性間質(zhì)性肝炎、Wilson病等。隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，很多含有銅離子的污染物排放入江河湖泊中，污染了土壤、水源甚至是日常食用的糧食蔬菜，給人類的生活和健康造成了嚴(yán)重的危害，因此，對(duì)環(huán)境中銅離子的檢測(cè)是環(huán)境評(píng)估中必不可少的。目前常用的銅離子檢測(cè)方法有化學(xué)分析法、極譜法、電感耦合法和原子吸收法，這些方法均因操作繁瑣、需要專用的儀器及實(shí)驗(yàn)室配備等存在一定局限性，而生物檢測(cè)技術(shù)則很好地克服了以上不足。 現(xiàn)有的關(guān)于銅離子生物檢測(cè)技術(shù)的研究主要基于大腸埃希菌體內(nèi)具有針對(duì)銅離子的精細(xì)調(diào)控系統(tǒng)： CopA是一類P-型ATPase，作用是將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的銅離子向核周質(zhì)泵出；CueO是一類氧化酶，作用是在核周質(zhì)內(nèi)將Cu+氧化為Cu2+，防止核周質(zhì)內(nèi)銅離子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，cus系統(tǒng)負(fù)責(zé)將核周質(zhì)內(nèi)的Cu2+向細(xì)胞外環(huán)境泵出，這些作用受到CueR調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)。國(guó)內(nèi)外研究人員嘗試?yán)肅opA啟動(dòng)子融合報(bào)告基因，以野生型大腸埃希菌作為宿主菌構(gòu)建生物傳感器來(lái)檢測(cè)銅離子，其特異性不錯(cuò)，但是敏感性不高，更為重要的是細(xì)菌長(zhǎng)期處于高銅環(huán)境會(huì)由于自身的保護(hù)機(jī)制而產(chǎn)生銅離子耐受現(xiàn)象，造成檢測(cè)結(jié)果的不穩(wěn)定，不能用于污染物的檢測(cè)。本研究利用基因敲除技術(shù)對(duì)宿主菌進(jìn)行改造，構(gòu)建了能夠檢測(cè)銅離子的特異、敏感型微生物傳感器，有望應(yīng)用于環(huán)境中銅離子的檢測(cè)。 研究?jī)?nèi)容： 基于生物檢測(cè)法檢測(cè)銅敏感性不高是由于銅離子不能順暢進(jìn)入大腸埃希菌導(dǎo)致的假設(shè)，我們對(duì)大腸埃希菌進(jìn)行改造，并從以下四個(gè)方面進(jìn)行研究： 1）敲除大腸埃希菌體內(nèi)負(fù)責(zé)將銅離子從細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外泵出的基因以及影響銅離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的基因； 2）利用光量更強(qiáng)的GFPmut2作為報(bào)告基因構(gòu)建融合報(bào)告載體檢測(cè)銅離子； 3）對(duì)構(gòu)建好的生物傳感器進(jìn)行檢測(cè)條件的優(yōu)化以及相關(guān)參數(shù)的測(cè)定； 4）推廣應(yīng)用于水源、土壤、蔬菜和食品等銅離子的測(cè)定。 研究結(jié)果: 通過基因敲除技術(shù)敲除大腸埃希菌體內(nèi)負(fù)責(zé)將銅離子從細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外泵出的基因copA和cusA以及影響銅離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的基因cueO，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示△copA-△cueO-△cusA突變菌對(duì)銅離子非常敏感，在M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)其敏感性是野生型大腸桿菌MC4100的64倍。以其為宿主菌，同時(shí)以光亮更強(qiáng)的GFPmut2作為報(bào)告標(biāo)志基因構(gòu)建融合報(bào)告載體，構(gòu)建得到的傳感器對(duì)銅離子敏感性最高，線性范圍最好，其敏感性為野生型的35倍左右，不僅極易攝取外環(huán)境中的銅離子，使外環(huán)境中銅離子的痕量變化被突變菌株所監(jiān)測(cè)到，且保持對(duì)銅離子高敏感狀態(tài)的穩(wěn)定性和持久性。 該傳感器線性檢測(cè)范圍為5.0×10-5-2.5×10-3 mM（0.0032-0.16 mg/L），國(guó)家規(guī)定Cu2+檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法——原子吸收光譜法測(cè)定水樣的檢測(cè)范圍是0.05-5 mg/L，相比之下該生物傳感器最低檢出限更低，敏感性更高，更適于痕量Cu2+的檢測(cè)。 研究成果： 1）專利保存菌種一株，保存號(hào)為CGMCC No.4624，命名E. coli WMC-006 2）以學(xué)生為第一申請(qǐng)人申請(qǐng)專利，已獲得專利受理書。 3）已獲得學(xué)校推薦，參與2011年浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃（新苗人才計(jì)劃）的申報(bào)。 4）榮獲浙江省第二屆大學(xué)生生命科學(xué)競(jìng)賽一等獎(jiǎng)。 創(chuàng)新之處： 1）本研究通過基因敲除技術(shù)敲除大腸埃希菌體內(nèi)維持Cu2+穩(wěn)態(tài)的3個(gè)基因，構(gòu)建對(duì)Cu2+高度敏感的三基因突變菌作為宿主菌，解決了普通微生物作為生物傳感器宿主菌檢測(cè)敏感性不高的問題。 2）該生物傳感器以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白作為報(bào)告基因，產(chǎn)生的熒光強(qiáng)弱可以通過肉眼觀察判斷，無(wú)需紫外激發(fā)，為野外實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)帶來(lái)方便。 3）本方法為監(jiān)測(cè)影響到人類健康、食品安全的重金屬銅提供了一種簡(jiǎn)便、高效、高性價(jià)比的解決方案。

作品圖片

  • 重金屬銅檢測(cè)生物傳感器的構(gòu)建及其初步應(yīng)用
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作品專業(yè)信息

撰寫目的和基本思路

目的：構(gòu)建特異、敏感的銅離子檢測(cè)生物傳感器。 基本思路：選用綠色熒光蛋白GFPmut2為報(bào)告標(biāo)志物，利用E. coli copA啟動(dòng)子來(lái)構(gòu)建融合報(bào)告載體；采用Red重組系統(tǒng)敲除野生型E. coli MC4100菌體內(nèi)負(fù)責(zé)維持銅離子穩(wěn)態(tài)的三個(gè)基因，構(gòu)建對(duì)銅離子高度敏感的突變菌株作為宿主菌；然后進(jìn)行條件的優(yōu)化及特異性、敏感性、最適檢測(cè)范圍等相關(guān)參數(shù)的測(cè)定；最后利用該傳感器檢測(cè)水樣中的銅離子。

科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處

本作品選用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白作為報(bào)告標(biāo)志物，利用E. coli copA啟動(dòng)子來(lái)構(gòu)建融合報(bào)告載體，同時(shí)利用基因敲除技術(shù)對(duì)宿主菌進(jìn)行改造，解決了普通微生物作為宿主菌檢測(cè)銅離子敏感性不高的問題，更是避免了野生型大腸桿菌的銅離子耐受現(xiàn)象而造成檢測(cè)結(jié)果的不穩(wěn)定，構(gòu)建了能夠檢測(cè)銅離子的特異、敏感型微生物傳感器，為檢測(cè)銅離子提供了一種簡(jiǎn)便、高效、高性價(jià)比的解決方案。

應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義

本研究利用GFPmut2作為報(bào)告標(biāo)志物，不但具有通用性強(qiáng)、易于實(shí)現(xiàn)融合表達(dá)、熒光穩(wěn)定、檢測(cè)方便、無(wú)毒害等優(yōu)點(diǎn)，而且具有比普通綠色熒光蛋白更強(qiáng)的熒光信號(hào)，日光中的藍(lán)光就可以激發(fā)出亮綠色的熒光，為野外實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)帶來(lái)很大方便。同時(shí)以細(xì)菌作為宿主菌，檢測(cè)快速﹑成本低且易于維護(hù)，并且該生物傳感器對(duì)于銅離子的檢測(cè)具有很高的敏感度及特異性，有望應(yīng)用于銅離子檢測(cè)的初篩。

學(xué)術(shù)論文摘要

重金屬銅的檢測(cè)是評(píng)價(jià)環(huán)境污染的重要指標(biāo)之一。為構(gòu)建能特異、敏感檢測(cè)環(huán)境中銅離子的生物傳感器，我們選用綠色熒光蛋白GFPmut2作為報(bào)告標(biāo)志物，利用E. coli copA基因啟動(dòng)子來(lái)構(gòu)建融合報(bào)告載體PcopA::gfpmut2-pET28a；采用Red重組系統(tǒng)敲除野生型E. coli MC4100菌體內(nèi)負(fù)責(zé)維持銅離子穩(wěn)定狀態(tài)的copA﹑cueO和cusA三個(gè)基因，構(gòu)建對(duì)銅離子高度敏感的ΔcusA-ΔcopA-ΔcueO三基因突變菌株作為宿主菌；然后對(duì)此生物傳感器進(jìn)行測(cè)定條件的優(yōu)化及特異性、敏感性、最適檢測(cè)范圍等相關(guān)參數(shù)的測(cè)定；最后利用該傳感器檢測(cè)水樣中的銅離子。研究結(jié)果表明，此生物傳感器對(duì)銅離子具有敏感性高、特異性強(qiáng)和檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)銅離子的敏感性為野生型菌株的35倍左右，且僅被銅離子誘導(dǎo)，而對(duì)其它金屬離子不敏感，最適檢測(cè)銅離子濃度范圍為5.0×10-5-2.5×10-3 mM。該項(xiàng)研究成功地構(gòu)建了特異、敏感檢測(cè)銅離子的生物傳感器，并將其初步應(yīng)用于水樣中銅離子的檢測(cè)，為監(jiān)測(cè)影響到人類健康﹑食品安全的重金屬銅離子提供了一種簡(jiǎn)便、高效、高性價(jià)比的實(shí)施方案。

獲獎(jiǎng)情況

1. 本作品的前期研究?jī)?nèi)容榮獲浙江省第二屆大學(xué)生生命科學(xué)競(jìng)賽一等獎(jiǎng)。 2. 該作品獲得的能夠檢測(cè)重金屬銅的敏感菌株已經(jīng)保存到中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心，編號(hào)為CGMCC No.4624，命名E. coli WMC-006；為了保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)，論文雖已完成，但尚未在任何會(huì)議、雜志、報(bào)刊上公開發(fā)表。 3. 該作品的后續(xù)研究已獲得學(xué)校推薦，參與2011年浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃（新苗人才計(jì)劃）的申報(bào)中

鑒定結(jié)果

該作品通過基因敲除等技術(shù)成功構(gòu)建對(duì)重金屬銅高度敏感、特異的生物檢測(cè)傳感器，可以應(yīng)用于銅離子檢測(cè)的初篩，同時(shí)專利申請(qǐng)已被受理，并獲浙江省第二屆大學(xué)生生命科學(xué)競(jìng)賽一等獎(jiǎng)，得到了評(píng)審專家的肯定和認(rèn)可。

參考文獻(xiàn)

技術(shù)： PCR擴(kuò)增技術(shù)、交叉PCR技術(shù)、基因敲除技術(shù)、基因克隆技術(shù)、電轉(zhuǎn)化技術(shù)、SDS-PAGE等。 技術(shù)文獻(xiàn)： 1. Muller T, Feichtinger H, Berger H, et al. Endemic Tyrolean infantile cirrhosis: an ecogenetic disorder. Lancet, 1996, 347(9005):877-880 2. Munson GP, Lam DL, Outten FW, et al. Identification of a copper-responsive two-component system on the chromosome of Escherichia coli K-12. J Bacteriol, 2000, 182(20):5864-5871 4. Ivask A, Rolova T, Kahru A. A suite of recombinant luminescent bacterial strains for the quantification of bioavailable heavy metals and toxicity testing. BMC Biotechnol, 2009, 9:41 5. Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, 97(12):6640-6645 6. Abbruzzetti S, Grandi E, Viappiani C, et al. Kinetics of acid-induced spectral changes in the GFPmut2 chromophore. J Am Chem Soc, 2005, 127(2):626-635

同類課題研究水平概述

在過去幾年中，銅離子含量測(cè)定在環(huán)境分析中扮演著重要的角色。分析檢測(cè)方法也幾度易幟，從原有的極譜法到原子吸收分光光度法、光度法，到電感耦合法，但這些方法往往受到實(shí)驗(yàn)條件的限制，不僅需要大型儀器，同時(shí)還存在操作繁瑣等弊端。而生物檢測(cè)技術(shù)則克服了如上不足，生物檢測(cè)技術(shù)的基本原理即是利用模式生物對(duì)特定化學(xué)物質(zhì)的分子反應(yīng)機(jī)理，需要三種必需的元件：針對(duì)特定或具有相似性質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)的感應(yīng)器；由感應(yīng)器控制的啟動(dòng)子；受此啟動(dòng)子控制的報(bào)告基因。在設(shè)計(jì)生物檢測(cè)技術(shù)時(shí)，由于細(xì)菌具有在環(huán)境中大量存在﹑生長(zhǎng)快速﹑低成本及易維護(hù)等優(yōu)點(diǎn)而受到研究人員普遍親睞。在過去的研究中利用生物檢測(cè)法來(lái)檢測(cè)環(huán)境中的特定污染物已經(jīng)引起了極大的關(guān)注，至今已經(jīng)研發(fā)了一系列針對(duì)特定有機(jī)物和無(wú)機(jī)化合物的生物傳感器，如：重金屬、甲苯及其衍生物以及其它物質(zhì)。 現(xiàn)在對(duì)銅離子測(cè)定的生物檢測(cè)技術(shù)也有所研發(fā)，其中比較清楚大腸桿菌針對(duì)銅離子的反應(yīng)機(jī)理，大腸桿菌具有精細(xì)的調(diào)控系統(tǒng)使得細(xì)胞內(nèi)銅離子保持在較低的水平，CopA是一類P-型ATPase，作用是將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的銅離子向核周質(zhì)泵出；CueO是一類氧化酶，作用是在核周質(zhì)內(nèi)將Cu+氧化為Cu2+，防止核周質(zhì)內(nèi)銅離子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)（銅離子只有一價(jià)形式可以穿過細(xì)胞膜）；當(dāng)大腸桿菌處在低濃度的銅離子環(huán)境中，CopA和CueO會(huì)被大量的誘導(dǎo)表達(dá)，其受到CueR調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)。高濃度的銅離子會(huì)激活Cus系統(tǒng)，使得銅離子從核周質(zhì)向外環(huán)境泵出。這個(gè)機(jī)理提供了一個(gè)很好的檢測(cè)模式，研究人員嘗試?yán)胏opAp::lux和CueRCopA::LuxCDABE融合報(bào)告基因以野生型E. coli作為宿主菌來(lái)檢測(cè)銅離子，這些特異性不錯(cuò)，但是敏感性不是很高，更重要的是野生型大腸桿菌長(zhǎng)期處于高銅的環(huán)境由于自身的保護(hù)機(jī)制而造成銅離子耐受，其作為檢測(cè)銅的宿主菌會(huì)造成不穩(wěn)定，這些非常不利于污染物的檢測(cè)，必須采用新的方法提高生物學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)銅離子的敏感度。 本項(xiàng)目敲除copA、cueO和cusA基因，構(gòu)建了一株對(duì)銅離子高度敏感的大腸桿菌突變菌株，以其作為宿主菌來(lái)檢測(cè)銅離子，其靈敏度提高到野生型的35倍。且利用GFPmut2蛋白作為報(bào)告物，它比野生型GFP蛋白更亮，而且藍(lán)光就可以激發(fā)出亮綠色的熒光，不需要紫外設(shè)備愛就能觀測(cè)到熒光，因?yàn)槿展饫锞秃兴{(lán)光，這也為野外檢測(cè)帶來(lái)方便。
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