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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 蝴蝶蘭miR172的克隆與功能驗(yàn)證
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 很多miRNA在植物的成花過程中，對(duì)很多重要轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄后或者翻譯水平起調(diào)控作用，使植物開花時(shí)間的控制更加精細(xì)和復(fù)雜。其中最引人注意的是miR172，它的靶基因是AP2，在擬南芥中過量表達(dá)miR172會(huì)造成植物開花顯著提前，而過量表達(dá)其靶基因AP2會(huì)造成開花延遲。目前對(duì)植物miR172的研究?jī)H在擬南芥、水稻等模式生物或者重要農(nóng)作物中研究得比較深入，在園林觀賞植物中卻未見報(bào)道。
- 詳細(xì)介紹：
- 蝴蝶蘭是蘭科植物中最重要的一個(gè)屬，也是在分子生物學(xué)領(lǐng)域研究比較多的一種蘭科植物。研究參與蝴蝶蘭成花調(diào)控的miRNA對(duì)植物miRNA調(diào)控機(jī)理是一種補(bǔ)充。蝴蝶蘭是一種重要的經(jīng)濟(jì)花卉，具有很好的經(jīng)濟(jì)效益。但是蝴蝶蘭開花前營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)間很長(zhǎng)，一般為2年，且其成花要求的條件很嚴(yán)格，無法實(shí)現(xiàn)周年開花。目前主要催花的方法是通過春化作用，低溫誘導(dǎo)開花。但是低溫催花的耗電量大，增加了培養(yǎng)成本，而且能源的過量消耗不符合可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略要求。同時(shí)，低溫催花需要很好的密閉環(huán)境，容易滋生灰霉菌等真菌病害，降低了經(jīng)濟(jì)效益。 由此可見蝴蝶蘭成花途徑相關(guān)的miR172研究和進(jìn)一步應(yīng)用有助于低成本的實(shí)現(xiàn)蝴蝶蘭提前開花，具有很強(qiáng)的實(shí)踐意義。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 1 對(duì)蝴蝶蘭全基因組進(jìn)行特異性擴(kuò)增，獲得兩個(gè)miRNA172片段； 2 對(duì)上述新miRNA172測(cè)序，與已知的miRNA172做進(jìn)化分析和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)； 3 設(shè)計(jì)原位雜交探針和半定量RT-PCR檢測(cè)上述兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本和靶基因TOE1在蝴蝶蘭組織中的表達(dá)情況； 4 將新miRNA172轉(zhuǎn)基因到擬南芥中，統(tǒng)計(jì)T3代開花時(shí)間并觀察表型。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- miRNA是近幾年的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究熱點(diǎn)之一，其作用機(jī)理的研究無論在疾病治療還是遺傳育種中都會(huì)具有十分廣闊的應(yīng)用前景和科學(xué)意義。本研究首次以觀賞植物為材料，對(duì)開花調(diào)控miR172的作用機(jī)理進(jìn)行研究，具有一定的創(chuàng)新性。因?yàn)楹m相對(duì)擬南芥來說，分子生物學(xué)操作更加復(fù)雜，小分子RNA的研究更是首次。本研究的另一個(gè)目的是能夠創(chuàng)建蝴蝶蘭小分子miRNA的操作平臺(tái)，為研究其它蝴蝶蘭miRNA提供基礎(chǔ)。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 蘭科植物包含很多重要的經(jīng)濟(jì)花卉，但因其開花周期長(zhǎng)，人工催花的成本高，使市場(chǎng)價(jià)格提高。目前有基因工程方法轉(zhuǎn)化開花調(diào)控基因，但因調(diào)控途徑非常復(fù)雜，單個(gè)基因的表達(dá)變化，往往引起正、負(fù)調(diào)控共同作用，收效甚微，且可能對(duì)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)造成不良影響。本研究將轉(zhuǎn)錄因子上游起調(diào)控作用的microRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)基因和育種，有望在不對(duì)其它表型產(chǎn)生明顯改變的情況下促進(jìn)開花。穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因花卉也不存在安全問題，利于推廣應(yīng)用。
學(xué)術(shù)論文摘要
- miR172屬于microRNA，在植物花發(fā)育中被證明扮演重要角色，通過抑制靶基因——AP2轉(zhuǎn)錄因子家族的mRNA下調(diào)其蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而解除其于正?；ㄆ鞴傩纬芍械膲毫??；诒緦?shí)驗(yàn)室已有的蝴蝶蘭cDNA樣本，通過比對(duì)已知其它物種中的同源miR172序列設(shè)計(jì)引物，獲得兩種不同長(zhǎng)度的蝴蝶蘭miRNA172-like轉(zhuǎn)錄本，分別為100bp和250bp，并通過在蝴蝶蘭組織中進(jìn)行原位表達(dá)、半定量PCR、測(cè)序分析和轉(zhuǎn)基因模式生物對(duì)該miR172進(jìn)行了功能驗(yàn)證。新發(fā)現(xiàn)的PhmiR172具有促進(jìn)提前開花的功能，與已知的miR172基因具有極高的相似性，可以用于早花蝴蝶蘭株系的培育，并為進(jìn)一步理解蘭科植物的成花機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
獲獎(jiǎng)情況
- 1 專利申請(qǐng)一項(xiàng)： 專利申請(qǐng)?zhí)枺?0111006055.8 專利名稱：蝴蝶蘭miR172的克隆與功能驗(yàn)證 專利發(fā)明人：嚴(yán)欽驊，明鳳，韓穎穎。 2 第一作者撰寫SCI論文一篇：蝴蝶蘭miR172的克隆與功能驗(yàn)證，已完成初稿。
鑒定結(jié)果
- 專利申請(qǐng)?zhí)枺?0111006055.8，狀態(tài)：正在審查中。
參考文獻(xiàn)
- 1 Cell, 2004, 116: 281–297. 2 The Plant Cell, 2007, 19: 2736–2748. 3 The Plant Cell, 2003, 15: 2730–2741. 4 BMC Plant Biology, 2009, 9:149. 5 Journal of Experimental Botany, 2011, 62 (2):487-495. 6 The Plant Journal, 2007, 51: 840-849. 7 Developmental Biology, 2006, 295: 324 –326. 8 PNAS, 2005, 102(26): 9412-9417. 9 Plant.Mol. Biol, 2006, 61:781–793 10 Mol.Biol.Evol., 2006, 23(1):107–120.
同類課題研究水平概述
- miRNA作為非編碼序列廣泛存在于各物種的基因組中，但近十年才為人所關(guān)注。成熟的miRNA是一類長(zhǎng)度很短的單鏈小分子RNA，約20-24 nt，由一段具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的、長(zhǎng)度為70-80 nt 的單鏈RNA 前體(pre-miRNA)剪切后生成；與Argonaute (Ago)蛋白結(jié)合形成RISC（RNA- induced silencing complex），通過與靶mRNA的互補(bǔ)識(shí)別，介導(dǎo)RISC將其降解，從而下調(diào)靶基因的表達(dá)。功能上，它們參與轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)調(diào)控，在多種模式生物的發(fā)育過程，例如細(xì)胞分化、分裂、生長(zhǎng)、衰老、凋亡等調(diào)控途徑中表現(xiàn)出至關(guān)重要的地位。 目前人們對(duì)microRNA的了解并不深入，研究手段也有限。作為新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控因子，miRNA被證明在各類生物基因組中潛在的大量未知microRNA在遺傳調(diào)控?fù)?dān)當(dāng)了十分重要的角色，且在同類生物中往往具有很高的同源性，盡管如此，關(guān)于miRNA的探索依然具有十分廣闊的研究空間和應(yīng)用價(jià)值。因此目前的研究致力于一邊不斷尋找新的miRNA基因，并對(duì)已知miRNA通過克隆和分子探針實(shí)驗(yàn)來確定其在組織調(diào)控中的作用；一邊不斷探索miRNA作用的分子作用機(jī)制和靶基因。生物信息學(xué)的發(fā)展使得我們能夠快速?gòu)幕蚪M序列中搜索并推測(cè)新的miRNA以及其靶基因序列，但用這種方法存在一定的棄真或納偽風(fēng)險(xiǎn)，依然需要大量的分子克隆驗(yàn)證新基因的功能。 本研究對(duì)象miR172在植物中具有高度的保守性。已知它在擬南芥、水稻、煙草、玉米等五種中的同源基因，通過與靶基因AP2轉(zhuǎn)錄因子家族的mRNA互補(bǔ)結(jié)合將其識(shí)別，介導(dǎo)RISC將其降解。由于AP2家族基因的成員眾多，miR172也占據(jù)了與營(yíng)養(yǎng)-生殖發(fā)育轉(zhuǎn)變相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的相當(dāng)中心的地位。在花器官內(nèi)輪，miR172抑制AP2的過高表達(dá)，防止其誘導(dǎo)內(nèi)輪花器官轉(zhuǎn)變?yōu)榛ū徊o限增殖；在玉米中，miR172在頂端分生組織中下調(diào)glossy15(AP2-like)促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)結(jié)束進(jìn)入開花準(zhǔn)備階段；此外，miR172還獨(dú)立于CO參與了GI介導(dǎo)的光周期開花調(diào)控途徑。目前在單子葉蘭科植物中未見對(duì)miR172的研究，新發(fā)現(xiàn)的蝴蝶蘭miR172基因無疑對(duì)進(jìn)一步揭示蘭科植物成花機(jī)理充實(shí)了基礎(chǔ)，更重要的是，miR172在促進(jìn)植物開花同時(shí)對(duì)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的影響較小，最具投入生產(chǎn)、培育轉(zhuǎn)基因早花株系的價(jià)值。
