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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 擬南芥熱激因子AtAtHsfA1a表達(dá)純化的研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 本研究以構(gòu)建的表達(dá)擬南芥熱激因子AtHsfA1a的大腸桿菌E coli M15為材料，用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)AtHsfA1a，再通過Ni-NTA-Agarose親和層析純化表達(dá)的AtHsfA1a，通過SDS-PAGE電泳分析表達(dá)蛋白和純化蛋白，獲得了表達(dá)純化的AtHsfA1a。從基因表達(dá)調(diào)控水平上研究植物對(duì)逆境適應(yīng)的分子機(jī)制和研究耐逆境基因的作用機(jī)理，提高植物各種抗逆性有重大意義。
- 詳細(xì)介紹：
- 熱激轉(zhuǎn)錄因子又稱為熱激因子（heat shock transcription factors，HSFs）是真核生物熱激反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。在擬南芥中存在21個(gè)熱激因子的同源體，組成熱激因子家族。雖然目前對(duì)絕大多數(shù)同源體的功能還不了解，但研究顯示其中熱激因子AtHsfA1a是與耐逆境有關(guān)的主要調(diào)控因子，對(duì)AtHsfA1a逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理研究顯示，與大多數(shù)HSFs相似，在非逆境條件下，AtHsfA1a以非活性的單體形式存在，逆境誘導(dǎo)AtHsfA1a單體形成三體（活性）、與靶DNA啟動(dòng)子區(qū)熱激元件（HSE）特異性結(jié)合，從而調(diào)控逆境防御基因的表達(dá)。然而，AtHsfA1a在逆境應(yīng)答途徑下游中如何誘導(dǎo)防御基因的表達(dá)仍然不清楚。 因此本研究以構(gòu)建的表達(dá)擬南芥熱激因子AtHsfA1a的大腸桿菌E coli M15(pET30a/ His6- AtHsfA1a)為材料，用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)AtHsfA1a，再通過Ni-NTA-Agarose親和層析純化表達(dá)的AtHsfA1a，通過SDS-PAGE電泳分析表達(dá)蛋白和純化蛋白，獲得了表達(dá)純化的AtHsfA1a。 本作品建立了穩(wěn)定的適用于逆境應(yīng)答研究的AtHsfA1a蛋白的表達(dá)、純化體系，為研究AtHsfA1a的逆境應(yīng)答行為提供研究材料，為進(jìn)一步全面認(rèn)識(shí)AtHsfA1a調(diào)控功能多樣性的生理代謝基礎(chǔ)奠定基礎(chǔ)。從基因表達(dá)調(diào)控水平上研究植物對(duì)逆境適應(yīng)的分子機(jī)制以及研究耐逆境基因的作用機(jī)理，對(duì)揭示植物耐逆境反應(yīng)機(jī)理亦具有顯著意義，也是進(jìn)一步應(yīng)用耐逆境基因改善植物耐逆性的理論基礎(chǔ)，在農(nóng)業(yè)上對(duì)提高植物各種抗逆性具有重大意義。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 轉(zhuǎn)錄因子如何接收和傳導(dǎo)逆境信號(hào)和調(diào)控下游靶基因表達(dá)，目前沒有足夠依據(jù)揭示有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的逆境應(yīng)答機(jī)理。本研究以構(gòu)建的表達(dá)擬南芥熱激因HsfA1a的大腸桿菌 M15為材料，用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)AtHsfA1a，Ni-NTA-Agarose親和層析純化表達(dá)的AtHsfA1a，SDS-PAGE電泳分析表達(dá)蛋白和純化蛋白，獲得表達(dá)純化的AtHsfA1a
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 本作品建立穩(wěn)定的適用于逆境應(yīng)答研究的AtHsfA1a蛋白的表達(dá)、純化體系，為研究AtHsfA1a的逆境應(yīng)答行為提供研究材料。本項(xiàng)目將為進(jìn)一步研究AtHsfA1a接受逆境信號(hào)的化學(xué)本質(zhì)與機(jī)理，以及應(yīng)用基因工程方法改AtHsfA1a耐逆境功能提供理論基礎(chǔ)。本研究成果對(duì)揭示植物耐逆境機(jī)理具有重要意義,亦是用基因工程方法改善植物耐逆性的理論基礎(chǔ)。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 本研究結(jié)果為為研究AtHsfA1a的逆境應(yīng)答行為提供研究材料，為進(jìn)一步全面認(rèn)識(shí)AtHsfA1a調(diào)控功能多樣性的生理代謝基礎(chǔ)奠定基礎(chǔ)。從基因表達(dá)調(diào)控水平上研究植物對(duì)逆境適應(yīng)的分子機(jī)制以及研究耐逆境基因的作用機(jī)理，對(duì)揭示植物耐逆境反應(yīng)機(jī)理亦具有顯著意義，也是進(jìn)一步應(yīng)用耐逆境基因改善植物耐逆性的理論基礎(chǔ)，在農(nóng)業(yè)上對(duì)提高植物各種抗逆性具有重大意義。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 本研究以構(gòu)建的表達(dá)擬南芥熱激因子AtHsfA1a的大腸桿菌E coli M15(pET30a/ His6- AtHsfA1a)為材料，用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)AtHsfA1a，再通過Ni-NTA-Agarose親和層析純化表達(dá)的AtHsfA1a，通過SDS-PAGE電泳分析表達(dá)蛋白和純化蛋白，獲得了表達(dá)純化的AtHsfA1a。本研究結(jié)果為探討擬南芥HsfA1a在基因組的結(jié)合位點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)材料，為進(jìn)一步全面認(rèn)識(shí)AtHsfA1a調(diào)控功能多樣性的生理代謝基礎(chǔ)奠定基礎(chǔ)。
獲獎(jiǎng)情況
- 本作品是指導(dǎo)教師的科研課題，國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31060039）、云南省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2010ZC163）。
鑒定結(jié)果
- 該作品具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
參考文獻(xiàn)
- 論文所采用技術(shù)： 1、大腸桿菌Escherichia coli M15(pET30a/ His6- AtHsfA1a)的誘導(dǎo)表達(dá)技術(shù) 2、鎳柱親和層析技術(shù)純化蛋白技術(shù)。 3、SDS一PAGE電泳分析表達(dá)蛋白技術(shù)。 技術(shù)文獻(xiàn)檢索目錄： 1、Schoffl F.et al 1998. Regulation of the heat-shock response. Plant Physiol.117:1135-1141 2、Hubel and Schoffl 1994. Arabidopsis heat shock factor: Isolation and characterization of the gene and the recombinant protein. Plant Mol Biol 26: 353-362 3、Scharf KD, Rose S, ZottW, Schoffl F, Nover L. 1990. Three tomato genes code for heat stress transcription factors with a region of remarkable homology to the DNA - binding domain of the yeast HSF. EMBO J, 9 : 4495 -4501 4、Busch W et al 2005 Identification of novel Heat Shock Factor dependent genes and biochemical pathways in Arabidopsis thaliana Plant J 41: 1-14 5、Wu C. 1995. Heat shock transcription factors : structure and regulation . Annu Rev Cell Dev Biol, 11 :441 –469
同類課題研究水平概述
- 植物逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控防御基因表達(dá)中起重要作用，然而目前還沒有足夠依據(jù)來清楚證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控哪些防御基因，如何調(diào)控下游防御基因的表達(dá)。從基因表達(dá)調(diào)控水平上研究植物對(duì)逆境適應(yīng)的分子機(jī)制以及研究耐逆境基因的作用機(jī)理，對(duì)揭示植物耐逆境反應(yīng)機(jī)理亦具有顯著意義，也是進(jìn)一步應(yīng)用耐逆境基因改善植物耐逆性的理論基礎(chǔ)，在農(nóng)業(yè)上對(duì)提高植物各種抗逆性具有重大意義。植物熱激因子是真核生物熱激反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。目前對(duì)植物熱激因子的研究主要是以模式植物為對(duì)象，例如擬南芥。在擬南芥中存在21個(gè)熱激因子的同源體，組成熱激因子家族。擬南芥熱激因子家族基因最初由德國Tuebingen大學(xué)科研人員Sch?ffl, F. 等于90年代分離和克隆。雖然目前對(duì)絕大多數(shù)同源體的功能還不了解，但研究顯示其中HsfA1a是與耐逆境有關(guān)的主要調(diào)控因子，對(duì)HsfA1a逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理研究顯示，與大多數(shù)HSFs相似，在非逆境條件下，HsfA1a以非活性的單體形式存在，逆境誘導(dǎo)HsfA1a單體形成三體（活性）、以及與靶DNA結(jié)合，而且HsfA1a三體/靶DNA結(jié)合與熱激蛋白基因的表達(dá)呈相關(guān)性，是誘導(dǎo)靶基因表達(dá)的重要步驟；通過比對(duì)擬南芥HsfA1a與其它HSFs序列，鑒定了HsfA1a分子具有DNA 結(jié)合域、多聚體域、激活域、細(xì)胞核定位信號(hào)和細(xì)胞核輸出信號(hào)。然而，不清楚HsfA1a感應(yīng)逆境的功能區(qū)域位點(diǎn)是什么，不清楚HsfA1a在逆境應(yīng)答途徑上游中如何感應(yīng)逆境。目前國內(nèi)外研究工作的興趣主要是發(fā)現(xiàn)科學(xué)問題，還未見有關(guān)應(yīng)用上的專利。申請(qǐng)人的目前研究顯示，純化的擬南芥全長HsfA1a(His-tag融合蛋白)在體外能感應(yīng)高溫、酸、堿、過氧化氫逆境，并由單體形成三體、與靶DNA結(jié)合。顯示應(yīng)用純化蛋白可以模擬擬南芥HsfA1a的逆境應(yīng)答行為。因此，本研究擬以構(gòu)建的表達(dá)熱激因子AtHsfA1a的大腸桿菌Escherichia coli M15 (pET30a/ His6- AtHsfA1a)為實(shí)驗(yàn)材料，通過異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）的誘導(dǎo)表達(dá)，獲得表達(dá)的AtHsfA1a蛋白，并通過鎳親和層析獲得純化的AtHsfA1a蛋白，旨在為研究擬南芥AtHsfA1a在基因組的結(jié)合位點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)材料，為進(jìn)一步全面認(rèn)識(shí)AtHsfA1a調(diào)控功能多樣性的生理代謝基礎(chǔ)奠定基礎(chǔ)。
