基本信息
- 項目名稱：
- 擬南芥熱激因子AtAtHsfA1a表達純化的研究
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術論文
- 簡介：
- 本研究以構(gòu)建的表達擬南芥熱激因子AtHsfA1a的大腸桿菌E coli M15為材料，用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷誘導表達AtHsfA1a，再通過Ni-NTA-Agarose親和層析純化表達的AtHsfA1a，通過SDS-PAGE電泳分析表達蛋白和純化蛋白，獲得了表達純化的AtHsfA1a。從基因表達調(diào)控水平上研究植物對逆境適應的分子機制和研究耐逆境基因的作用機理，提高植物各種抗逆性有重大意義。
- 詳細介紹：
- 熱激轉(zhuǎn)錄因子又稱為熱激因子（heat shock transcription factors，HSFs）是真核生物熱激反應的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。在擬南芥中存在21個熱激因子的同源體，組成熱激因子家族。雖然目前對絕大多數(shù)同源體的功能還不了解，但研究顯示其中熱激因子AtHsfA1a是與耐逆境有關的主要調(diào)控因子，對AtHsfA1a逆境信號轉(zhuǎn)導機理研究顯示，與大多數(shù)HSFs相似，在非逆境條件下，AtHsfA1a以非活性的單體形式存在，逆境誘導AtHsfA1a單體形成三體（活性）、與靶DNA啟動子區(qū)熱激元件（HSE）特異性結(jié)合，從而調(diào)控逆境防御基因的表達。然而，AtHsfA1a在逆境應答途徑下游中如何誘導防御基因的表達仍然不清楚。 因此本研究以構(gòu)建的表達擬南芥熱激因子AtHsfA1a的大腸桿菌E coli M15(pET30a/ His6- AtHsfA1a)為材料，用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）誘導表達AtHsfA1a，再通過Ni-NTA-Agarose親和層析純化表達的AtHsfA1a，通過SDS-PAGE電泳分析表達蛋白和純化蛋白，獲得了表達純化的AtHsfA1a。 本作品建立了穩(wěn)定的適用于逆境應答研究的AtHsfA1a蛋白的表達、純化體系，為研究AtHsfA1a的逆境應答行為提供研究材料，為進一步全面認識AtHsfA1a調(diào)控功能多樣性的生理代謝基礎奠定基礎。從基因表達調(diào)控水平上研究植物對逆境適應的分子機制以及研究耐逆境基因的作用機理，對揭示植物耐逆境反應機理亦具有顯著意義，也是進一步應用耐逆境基因改善植物耐逆性的理論基礎，在農(nóng)業(yè)上對提高植物各種抗逆性具有重大意義。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 轉(zhuǎn)錄因子如何接收和傳導逆境信號和調(diào)控下游靶基因表達，目前沒有足夠依據(jù)揭示有關轉(zhuǎn)錄因子的逆境應答機理。本研究以構(gòu)建的表達擬南芥熱激因HsfA1a的大腸桿菌 M15為材料，用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷誘導表達AtHsfA1a，Ni-NTA-Agarose親和層析純化表達的AtHsfA1a，SDS-PAGE電泳分析表達蛋白和純化蛋白，獲得表達純化的AtHsfA1a
科學性、先進性及獨特之處
- 本作品建立穩(wěn)定的適用于逆境應答研究的AtHsfA1a蛋白的表達、純化體系，為研究AtHsfA1a的逆境應答行為提供研究材料。本項目將為進一步研究AtHsfA1a接受逆境信號的化學本質(zhì)與機理，以及應用基因工程方法改AtHsfA1a耐逆境功能提供理論基礎。本研究成果對揭示植物耐逆境機理具有重要意義,亦是用基因工程方法改善植物耐逆性的理論基礎。
應用價值和現(xiàn)實意義
- 本研究結(jié)果為為研究AtHsfA1a的逆境應答行為提供研究材料，為進一步全面認識AtHsfA1a調(diào)控功能多樣性的生理代謝基礎奠定基礎。從基因表達調(diào)控水平上研究植物對逆境適應的分子機制以及研究耐逆境基因的作用機理，對揭示植物耐逆境反應機理亦具有顯著意義，也是進一步應用耐逆境基因改善植物耐逆性的理論基礎，在農(nóng)業(yè)上對提高植物各種抗逆性具有重大意義。
學術論文摘要
- 本研究以構(gòu)建的表達擬南芥熱激因子AtHsfA1a的大腸桿菌E coli M15(pET30a/ His6- AtHsfA1a)為材料，用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）誘導表達AtHsfA1a，再通過Ni-NTA-Agarose親和層析純化表達的AtHsfA1a，通過SDS-PAGE電泳分析表達蛋白和純化蛋白，獲得了表達純化的AtHsfA1a。本研究結(jié)果為探討擬南芥HsfA1a在基因組的結(jié)合位點提供實驗材料，為進一步全面認識AtHsfA1a調(diào)控功能多樣性的生理代謝基礎奠定基礎。
獲獎情況
- 本作品是指導教師的科研課題，國家自然科學基金項目（31060039）、云南省自然科學基金面上項目（2010ZC163）。
鑒定結(jié)果
- 該作品具有實際應用價值。
參考文獻
- 論文所采用技術： 1、大腸桿菌Escherichia coli M15(pET30a/ His6- AtHsfA1a)的誘導表達技術 2、鎳柱親和層析技術純化蛋白技術。 3、SDS一PAGE電泳分析表達蛋白技術。 技術文獻檢索目錄： 1、Schoffl F.et al 1998. Regulation of the heat-shock response. Plant Physiol.117:1135-1141 2、Hubel and Schoffl 1994. Arabidopsis heat shock factor: Isolation and characterization of the gene and the recombinant protein. Plant Mol Biol 26: 353-362 3、Scharf KD, Rose S, ZottW, Schoffl F, Nover L. 1990. Three tomato genes code for heat stress transcription factors with a region of remarkable homology to the DNA - binding domain of the yeast HSF. EMBO J, 9 : 4495 -4501 4、Busch W et al 2005 Identification of novel Heat Shock Factor dependent genes and biochemical pathways in Arabidopsis thaliana Plant J 41: 1-14 5、Wu C. 1995. Heat shock transcription factors : structure and regulation . Annu Rev Cell Dev Biol, 11 :441 –469
同類課題研究水平概述
- 植物逆境信號轉(zhuǎn)導的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控防御基因表達中起重要作用，然而目前還沒有足夠依據(jù)來清楚證實轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控哪些防御基因，如何調(diào)控下游防御基因的表達。從基因表達調(diào)控水平上研究植物對逆境適應的分子機制以及研究耐逆境基因的作用機理，對揭示植物耐逆境反應機理亦具有顯著意義，也是進一步應用耐逆境基因改善植物耐逆性的理論基礎，在農(nóng)業(yè)上對提高植物各種抗逆性具有重大意義。植物熱激因子是真核生物熱激反應的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。目前對植物熱激因子的研究主要是以模式植物為對象，例如擬南芥。在擬南芥中存在21個熱激因子的同源體，組成熱激因子家族。擬南芥熱激因子家族基因最初由德國Tuebingen大學科研人員Sch?ffl, F. 等于90年代分離和克隆。雖然目前對絕大多數(shù)同源體的功能還不了解，但研究顯示其中HsfA1a是與耐逆境有關的主要調(diào)控因子，對HsfA1a逆境信號轉(zhuǎn)導機理研究顯示，與大多數(shù)HSFs相似，在非逆境條件下，HsfA1a以非活性的單體形式存在，逆境誘導HsfA1a單體形成三體（活性）、以及與靶DNA結(jié)合，而且HsfA1a三體/靶DNA結(jié)合與熱激蛋白基因的表達呈相關性，是誘導靶基因表達的重要步驟；通過比對擬南芥HsfA1a與其它HSFs序列，鑒定了HsfA1a分子具有DNA 結(jié)合域、多聚體域、激活域、細胞核定位信號和細胞核輸出信號。然而，不清楚HsfA1a感應逆境的功能區(qū)域位點是什么，不清楚HsfA1a在逆境應答途徑上游中如何感應逆境。目前國內(nèi)外研究工作的興趣主要是發(fā)現(xiàn)科學問題，還未見有關應用上的專利。申請人的目前研究顯示，純化的擬南芥全長HsfA1a(His-tag融合蛋白)在體外能感應高溫、酸、堿、過氧化氫逆境，并由單體形成三體、與靶DNA結(jié)合。顯示應用純化蛋白可以模擬擬南芥HsfA1a的逆境應答行為。因此，本研究擬以構(gòu)建的表達熱激因子AtHsfA1a的大腸桿菌Escherichia coli M15 (pET30a/ His6- AtHsfA1a)為實驗材料，通過異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）的誘導表達，獲得表達的AtHsfA1a蛋白，并通過鎳親和層析獲得純化的AtHsfA1a蛋白，旨在為研究擬南芥AtHsfA1a在基因組的結(jié)合位點提供實驗材料，為進一步全面認識AtHsfA1a調(diào)控功能多樣性的生理代謝基礎奠定基礎。
