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基本信息

項目名稱:
寧強矮馬與哈薩克馬GHR外顯子10部分序列變異分析
小類:
生命科學
簡介:
通過對寧強矮馬、哈薩克馬和其他動物生長激素受體基因外顯子10部分序列進行分析,為寧強矮馬、哈薩克馬的分子系統(tǒng)學地位和生長機制的研究提供分子水平的科學依據。通過PCR擴增寧強矮馬和哈薩克馬的生長激素受體基因外顯子10部分序列,并進行測序,用DNAMAN軟件對不同動物的生長激素受體基因外顯子10部分序列進行比對分析。
詳細介紹:
寧強矮馬與哈薩克馬GHR外顯子10部分序列變異分析 王進,張曉康 張翠翠 劉芳妮 (陜西理工學院生物科學與工程學院,陜西 漢中 723000) [摘要] 【目的】通過對寧強矮馬、哈薩克馬和其他動物生長激素受體基因外顯子10序列進行分析,為寧強矮馬、哈薩克馬的分子系統(tǒng)學地位和生長機制的研究提供分子水平的科學依據。【方法】通過PCR擴增寧強矮馬和哈薩克馬的生長激素受體基因外顯子10,并進行測序,用DNAMAN軟件對不同動物的生長激素受體基因外顯子10序列進行比對分析。【結果】所研究的個體間有1個SNP位點,以家馬生長激素受體基因外顯子108序列(AF39287)為標準,寧強矮馬539位點缺失1個堿基A,哈薩克馬該位點由A→G,這些變異導致氨基酸發(fā)生改變,可能影響其生物學功能。本研究以生長激素受體基因外顯子10序列為基本數據對不同物種進行系統(tǒng)樹構建,發(fā)現在該位點上,所選動物的親緣關系與生物進化樹一致。 [關鍵詞] 寧強矮馬;哈薩克馬;GHR外顯子10;序列分析 Variation Analysis of Part Sequences of GHR Exon 10 in Ningqiang Pony and Kazakh Horse (School of Biological Science and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, Shaanxi) Abstract: 【Objective】In order to provide scientific basis for the origin and growth mechanism of Ningqiang pony and Kazakh horse, the sequence of GHR exon10 of Ningqiang pony, Kazakh horse and other animals was studied. 【Method】In the study, the PCR amplification, sequencing and DNAMAN software were used to analyze the sequences of GHR exon10 of different animals. 【Result】There was one SNP locus in the coding region. As the sequence of AF392878 as standard, we found there was a base deletion of A in Ningqiang pony and a transition of A→G in Kazakh horse, all these variations can cause amino acid change. Through analysis of clustering based on the sequence of GHR exon10, the genetic relationship of animals in the study was identical with biological cladogram. Key words: Ningqiang horse:,Kazakh horse;,GHR exon 10, SSCP,Sequences analysis 馬(Equus caballus )屬于哺乳綱(Mammalia)奇蹄目(Perissodaetyla)馬科(Equidae)、馬屬(Equus),公認其起始于北美洲,古生物學家在中國發(fā)掘的資料卻證明,我國也是世界上馬種起源最早的國家之一。我國馬種極為豐富,按照馬種的歷史來源、生態(tài)環(huán)境及體尺類型等綜合因素分為五大類型。(一)蒙古馬、(二)西南馬、(三)河曲馬、(四)哈薩克馬、(五)西藏馬 [1]。寧強馬屬西南馬種,是陜西地方品種,以體質緊湊結實,耐艱苦,體形輕小,適應山區(qū)自然條件等為特征。寧強馬品種中存在一種低于106cm的矮馬群體,被稱為寧強矮馬,它是瀕臨絕跡的我國珍稀矮馬品種[2]。哈薩克馬產于新疆,是一種草原型馬種,頭中等大,清秀,耳朵短。頸細長,稍揚起,耆甲高,胸銷窄,后肢常呈現刀狀。現今伊犁哈薩克州一帶,即是漢代西域的烏孫國。兩千年前的西漢時代,漢武帝為尋找良馬,曾派張騫三使西域,得到的馬可能就是哈薩克馬的前身。到唐代中葉,回紇向唐朝賣馬,每年達十萬匹之多[3]。其中很多屬于哈薩克馬。因此,中國西北的一些馬種大多與哈薩克馬有一些血緣關系。 生長激素受體(GHR)是一種跨膜糖蛋白,是細胞因子/造血因子受體超家族的成員之一,大約有638個氨基酸殘基.分為3個區(qū):胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內區(qū)。由于生長激素為生物大分子,不能直接透過細胞膜,因此生長激素(GH)要發(fā)揮生長和代謝作用必須和其受體(GHR)相結合,它通過二聚體的形式和生長激素相結合,經過介導體將信息傳遞到細胞內,才能發(fā)揮其生物學功能[4]。馬的GHR基因在第21號染色體,包含10個外顯子,GHR基因轉錄的mRNA由1917 bp組成,GHR基因第10外顯子由904 bp組成,編碼301個氨基酸,形成胞內結構域[5,6]。本研究通過通過PCR技術擴增寧強矮馬和哈薩克馬的GHR基因第10外顯子并進行測序,通過與從GenBank獲得的馬和其他動物GHR基因外顯子10序列進行比對分析,分析寧強矮馬、哈薩克馬GHR基因的遺傳變異及其馬屬動物在該位點上的分子系統(tǒng)學地位,從生長激素受體基因探討寧強矮馬的矮化機制。 1 材料和方法 1.1 實驗材料及DNA提取 本研究采用簡單隨機抽樣法采集10匹寧強矮馬、12匹哈薩克馬血樣,加ACD抗凝,放入-70℃超低溫冰箱保存,根據分子克隆實驗指南[7],采用酚-氯仿抽提法提取基因組DNA, 4℃保存。 1.2引用序列和引物序列 由網站 查得不同動物生長激素受體基因序列(見表1),并根據馬外顯子10的序列(AF392878)采用軟件Primer5.0設計用于PCR擴增GHR exon10 部分序列的引物(見表2),引物序列由上海捷瑞生物科技有限公司合成。 表1 從GenBank引用的各種動物的GHR序列 種屬 GenBank登錄號 品種 馬屬(Equus caballus) AF392878 家馬horse 犬屬(Canis lupus familiaris) AY885397 狗(dog) 豬屬(Sus scrofa) NM_214254 家豬(Pig) 綿羊(Ovis aries) NM_001009323 綿羊(sheep) 牛屬(Bos taurus) NC_007318 家牛(cattle) 鼠屬(Rattus norvegicus) NC_005101 溝鼠(Norway rat) 歐洲兔(Oryctolagus cuniculus) NC_013679 索貝克(Thorbecke) 黑猩猩(Pan troglodytes) NC_006472 黑猩猩chimpanzee 人類(Homo sapiens) NC_000005 人human 雞(Gallus gallus) NC_006127 紅色原雞(red jungle fowl) 爪蟾(Xenopus laevis) NM_001088509 非洲爪蟾(African clawed frog) 魚(Oryzias latipes) NM_001122905 日本青鳉(Japanese medaka) 表2 引物序列及最適退火溫度 引物名稱 引物序列(5`→3`) 起止位點 擴增片段長度 退火溫度 GHR-1 F:GTTGCTCAGCCACAAAGGTT 254 470 216 57.4 R:TTGCCAGTGAACTCGGATTG GHR-2 F:GAGTTCACTGGCAAACATCG 457 739 282 57.4 R:AAGGCTTTCTGTGGTGATGT 1.3 PCR擴增反應體系及程序 PCR反應總體系為25μL:10×PCR緩沖液(含15mM Mg2+)2.5μL,dNTP (25mM) 2.0μL,上下游引物 (10pmol)各1 μL,Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL ,DNA模板 (50ng/μL) 2.0μL,超純水16.3μL。 PCR擴增條件:94℃預變性2min, 94℃變性30s,X℃退火30s,72℃延伸45s,35個循環(huán),然后72℃延伸10 min,4℃保存。 1.4統(tǒng)計分析 采用DNAMAN分析軟件對寧強矮馬和哈薩克馬生長激素受體基因exon10的部分序列進行比對分析,并以GHR外顯子10序列為基礎對馬及其他幾種動物進行了進行了同源性分析和系統(tǒng)樹構建。 2 結果與分析 2.1兩種中國地方馬GHR列比對分析 馬的GHR基因是在第21號染色體,GHR基因包含10個外顯子,GHR基因轉錄的mRNA由1917 bp組成,其中第10外顯子由904bp組成,編碼301個氨基酸。通過對寧強馬、哈薩克馬兩種馬種3個個體生長激素受體基因GHR外顯子10序列研究發(fā)現:哈薩克馬19號與GenBank公布的馬的GHR exon10(AF392878)一致,寧強矮馬1號和哈薩克馬1 8號均在539位點發(fā)生變異(如圖5)。寧強矮馬1號發(fā)生缺失突變,引起該位點以后AA序列的變異,從而導致寧強矮馬生長激素受體的變化,影響其功能的,這可能造成寧強馬矮化機制形成的一個因素。哈薩克馬1 8號此處由A→G,導致此處氨基酸由Lys→Arg,可能影響生長激素受體結構和功能的改變。 馬-AF392878 CTCAACTAAGCAATCCGAGTTCACTGGCAAACATCGACTTTTATGCCCAGGTAAG 495 哈薩克馬19-3 ------------------------------------------------------- 495 哈薩克馬18-3 ------------------------------------------------------- 495 寧強矮馬1-3 ------------------------------------------------------- 495 馬-AF392878 CGACATTACGCCAGCAGGGAGTGTGGTCCTTTCCCCGGGCCAAAAAAACAAGACA 550 哈薩克馬19-3 ------------------------------------------------------- 550 哈薩克馬18-3 -------------------------------------------g----------- 550 寧強矮馬1-3 -------------------------------------------.----------- 549 馬-AF392878 GGGATATCCCAATGTGACATGCATCCCGAAGTGGTCTCACTCTGCCAAGCCAACT 605 哈薩克馬19-3 ------------------------------------------------------- 605 哈薩克馬18-3 ------------------------------------------------------- 605 寧強矮馬1-3 ------------------------------------------------------- 604 圖5 馬生長激素受體基因外顯子10區(qū)部分序列比對分析 2.2不同物種GHR外顯子10的同源性和系統(tǒng)進化樹分析 本研究通過比對分析了從魚到人12種脊椎動物的生長激素受體基因GHR exon10的DNA 序列(見圖6),發(fā)現豬和馬的GHR序列同源性最高,達到91.9%,其次為狗和馬,達到90.8%。各種動物GHR exon10 序列的同源性與生物的進化關系基本一致,人同黑猩猩同源性最高,為99.2%,其次為牛和羊97.2%,哺乳動物GHR exon10的同源性較高,其次與雞,然后是非洲爪蟾,同源性最低的是與魚。 以生長激素受體基因GHR exon10為基本數據進行12種脊椎動物的系統(tǒng)進化樹構建(見圖7),結果發(fā)現狗和馬聚為一類,綿羊與牛聚為一類,人與黑猩猩聚為一類,然后綿羊、牛、馬、狗和豬聚為一大類,說明在馬屬動物馬屬動物與豬和狗的親緣關系最近,綿羊和牛與馬的關系較近,靈長目與馬屬親緣關系與馬稍遠,其次為兔、鼠、雞和非洲爪蟾,魚與馬屬的親緣關系最遠。 表3 各種動物生長激素受體外基因外顯子10序列的同源性和遺傳距離 物種 豬 爪蟾 狗 黑猩猩 雞 馬 綿羊 牛 人 鼠 兔 魚 豬 - 61.6 89.6% 89.3% 68.9% 91.9% 91.4% 91.1% 88.7% 79.3% 86.1% 38.8% 爪蟾 0.384 - 60.6% 60.2% 61.4% 62.1% 61.7% 61.0% 60.1% 59.6% 61.3% 38.1% 狗 0.104 0.394 - 86.0% 68.4% 90.8% 86.7% 86.5% 85.8% 79.5% 83.7% 40.5% 黑猩猩 0.107 0.398 0.140 - 67.8% 89.4% 87.4% 87.3% 99.2% 79.0% 84.7% 38.2% 雞 0.311 0.386 0.316 0.322 - 69.3% 67.7% 67.5% 67.6% 64.1% 66.8% 38.8% 馬 0.081 0.379 0.092 0.106 0.307 - 89.7% 89.9% 89.3% 78.8% 86.8% 38.9% 綿羊 0.086 0.383 0.133 0.126 0.323 0.103 - 97.2% 87.1% 78.7% 84.1% 38.8% 牛 0.089 0.390 0.135 0.127 0.325 0.101 0.028 - 86.9% 77.7% 83.6% 39.0% 人 0.113 0.399 0.142 0.008 0.324 0.107 0.129 0.131 - 78.8% 84.0% 37.9% 鼠 0.207 0.404 0.205 0.210 0.359 0.212 0.213 0.223 0.212 - 75.9% 39.4% 兔 0.139 0.387 0.163 0.153 0.332 0.132 0.159 0.164 0.160 0.241 - 38.9% 魚 0.612 0.619 0.595 0.618 0.612 0.611 0.612 0.610 0.621 0.606 0.611 - 圖6 不同物種生長激素受體基因外顯子10序列的同源樹 圖7 基于生長激素受體基因外顯子10序列的構建的不同物種的系統(tǒng)進化樹 3 討論 隨著人們對生物多樣性重要性認識的不斷深入,馬屬動物的研究也漸漸受到了重視,尤其是矮馬的保護和研究受到了政府的重視和扶持??v觀人類社會的發(fā)展,矮馬業(yè)幾經沉浮,曾經分布廣泛興盛一時,但因為不適應軍事和生產上對畜力的需求而被淘汰或被雜種馬所取代[8]。中國矮馬是世界除英國設特蘭矮馬(Shetland Pony)外,另一個最大的原始矮馬資源庫,主要分布在西南地區(qū),分別為 廣西矮馬(Guangxi Pony)、 貴州矮馬(Guizhou Pony)、云南矮馬(YunnanPony)、四川矮馬(Sichuan Pony)和陜西矮馬(ShaanxiPony),且這些馬受外來品種入侵較小,保持了較為完整的基因庫,遺傳資源豐富[9]。人民生活水平提高促進了娛樂生活更加多樣化,在旅游、觀賞和兒童活動等方面,矮馬具有很高的潛在價值,矮馬品種的保護開發(fā)和專門化培育受到了學者、企業(yè)和相關部門的高度重視,那么研究影響生長性狀的基因對我國矮馬品種進一步矮化培育有重要意義 目前,多數學者的研究主要集中在中國馬的遺傳多樣性及其起源進化方面,例如芒來研究了蒙古馬等北方馬種的遺傳多樣性[10,11],安麗萍等也只是通過細胞色素b探討了普氏野馬與蒙古馬的遺傳多態(tài)性[12],雷初朝研究了中國馬的起源進化等[13]。隨著馬分子水平研究的深入和其開發(fā)利用途徑的拓展,馬的功能基因的研究也在不斷擴充,芒來等研究了蒙古馬的生長激素基因、多巴胺D4受體基因、5一羥色胺能基因、Mu阿片受體基因、IGF-I基因、ELA—DQA基因和MSTN基因等[14-22],蔣欽楊等研究了廣西百色矮馬的GH和GHR基因[23],張濤等研究了寧強矮馬的GH基因[24],這都為中國馬種的保護和開發(fā)奠定了一定得分子生物學基礎,也將促進中國馬業(yè)的快速發(fā)展。 本研究以NCBI公布的家馬生長激素受體基因外顯子10序列為標準,進行分析發(fā)現哈薩克馬19與公布序列一致,哈薩克馬1 8號在539為由A→G,寧強矮馬1號在539位發(fā)生缺失突變,導致AA序列的變異。以GHR序列為基礎的聚類分析表明馬屬動物GHR exon10的同源性最高,其序列與豬的最為接近達到91.9%,與魚類最遠,本研究結果符合生物系統(tǒng)進化樹關系,為馬屬動物的進化在GHR基因方面提供了補充材料,也為寧強矮馬矮小機制和哈薩克馬的生長發(fā)育研究奠定分子遺傳學了基礎。

作品圖片

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作品專業(yè)信息

撰寫目的和基本思路

目的:通過對陜西漢中寧強馬生長激素受體基因外顯子10的序列進行分析,寧強馬的起源和矮小機制的研究提供分子水平的科學依據。 基本思路:樣本采集-DNA提取——GHRexon10 PCR擴增引物設計——PCR擴增——SSCP分析——基因型判定——PCR產物測序——序列比對分析——基因功能預測——基于該位點進行聚類分析。

科學性、先進性及獨特之處

該文章采用PCR-SSCP和測序技術在生長性狀相關的基因GHR上對寧強馬的矮小形成機制進行了初步探討,并在該位點進行不同物種的系統(tǒng)進化關系研究,發(fā)現了寧強馬在GHR exon 10 上存在一個堿基缺失,可能與其生長發(fā)育有關,通過聚類分析發(fā)現馬與豬的GHRexon10序列同源性最高。

應用價值和現實意義

該研究結果為寧強馬矮化機制形成提供給了分子生物學依據,并為其起源進化方面研究補充了GHR方面的資料。該成果為寧強馬的資源保護和開發(fā)奠定了基礎,具有很好的潛在科學價值。

學術論文摘要

本研究主要目的是通過對寧強矮馬、哈薩克馬和其他動物生長激素受體基因外顯子10序列進行分析,為寧強矮馬、哈薩克馬的分子系統(tǒng)學地位和生長機制的研究提供分子水平的科學依據。該實驗通過PCR擴增寧強矮馬和哈薩克馬的生長激素受體基因外顯子10,并進行測序,用DNAMAN軟件對不同動物的生長激素受體基因外顯子10序列進行比對分析。研究發(fā)現兩個品種不同個體間有1個SNP位點,以家馬生長激素受體基因外顯子108序列(AF39287)為標準,寧強矮馬539位點缺失1個堿基A,哈薩克馬該位點由A→G,這些變異導致氨基酸發(fā)生改變,可能影響其生物學功能。本研究以生長激素受體基因外顯子10序列為基本數據對不同物種進行系統(tǒng)樹構建,發(fā)現在該位點上,所選動物的親緣關系與生物進化樹一致。

獲獎情況

該論文投在《貴州農業(yè)科學》,已經被錄用,將在2011年7月中旬見刊。

鑒定結果

參考文獻

[1]陜西省家畜家禽品種志編輯委員會.陜西省家畜家禽品種志[M].三泰出版社,1988. [2]姚全福,趙一萍,芒來,等.我國地方馬種質資源多樣性研究進展[J].畜牧與食料科學,2009,30(10):126-129. [3]SUN Xiaofeng , GUO Qionglin,HU Wei1,etal. Molecular cloning of growth hormone receptor (GHR) fromcommon carp(Cyprinus carpioL.) and identification of itstwo forms of mRNA transcripts[J]. PROGRESS IN NATURAL SCIENCE,2006,16(11):1156-1163. [4]翻李虹.生長激素和生長激素受體的多樣性[J].生物學雜志,2002,19(4):10-12. [5]楚冬梅.生長激素受體基因單核苷酸多態(tài)性與特發(fā)性矮小的相關性[J],醫(yī)學綜述,2007,l 1(13):833-835. [6]薩姆布魯克J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T著.金冬雁,黎孟楓,侯云德等譯.分子克隆實驗指南(第二版)[M].北京:科學出版社,1992,463-481. [7] Lei CZ, Su R, Bower MA, Edwards CJ, Wang XB, Weining S, Liu L, Xie WM, Li F, Liu RY, Zhang YS, Zhang CM, Chen H. Multiple maternal origins of native modern and ancient horse populations in China[J]. AnimalGenetics, 2009, 40(6): 933-944. [8] 張焱如, 烏尼爾夫, 芒 來. 三河馬生長激素基因的克隆與序列分析[J]. 華北農學報, 2006, 21 (4): 110-113.

同類課題研究水平概述

目前,多數學者的研究主要集中在中國馬的遺傳多樣性及其起源進化方面,例如芒來研究了蒙古馬等北方馬種的遺傳多樣性,安麗萍等也只是通過細胞色素b探討了普氏野馬與蒙古馬的遺傳多態(tài)性,雷初朝研究了中國馬的起源進化等。隨著馬分子水平研究的深入和其開發(fā)利用途徑的拓展,馬的功能基因的研究也在不斷擴充,芒來等研究了蒙古馬的生長激素基因、多巴胺D4受體基因、5一羥色胺能基因、Mu阿片受體基因、IGF-I基因、ELA—DQA基因和MSTN基因等,蔣欽楊等研究了廣西百色矮馬的GH和GHR基因,張濤等研究了寧強矮馬的GH基因,這都為中國馬種的保護和開發(fā)奠定了一定得分子生物學基礎,也將促進中國馬業(yè)的快速發(fā)展。
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