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基本信息

項(xiàng)目名稱(chēng)：
肺炎鏈球菌pbp2B、pbp2X和pbp1A基因突變與β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥相關(guān)性研究
小類(lèi)：
生命科學(xué)
簡(jiǎn)介：
肺炎鏈球菌是重要的人類(lèi)病原菌之一，全球每年死于肺炎鏈球菌感染約有300~500 萬(wàn)人。β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素是臨床上治療該菌感染的一線藥物。耐藥性不斷增強(qiáng)和耐藥株的流行是該菌所致疾病發(fā)病率不斷升高的根本原因。浙醫(yī)高專(zhuān)胡瑜潔同學(xué)在孫愛(ài)華教授指導(dǎo)下研究肺炎鏈球菌pbp2B、pbp2X和pbp1A基因突變與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的相關(guān)性，為研究細(xì)菌耐藥分子機(jī)制、篩選藥物新靶標(biāo)及抗耐藥新藥的研制提供依據(jù)。
詳細(xì)介紹：
肺炎鏈球菌是人類(lèi)細(xì)菌性肺炎主要病原體，也可引起細(xì)菌性腦膜炎、中耳炎等疾病。近年來(lái)，肺炎鏈球菌感染性疾病的發(fā)病率一直居高不下，全球死于肺炎鏈球菌感染的人數(shù)接近結(jié)核病，每年約為300~500 萬(wàn)人。眾所周知，β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素是臨床上治療肺炎鏈球菌等革蘭陽(yáng)性菌感染性疾病的一線藥物。例如，近年來(lái)日本、韓國(guó)等周邊國(guó)家耐藥菌株分離率高達(dá)30%-70%，北美和歐洲耐藥菌株分離率也可達(dá)35%-50%。因此，肺炎鏈球菌是重要的人類(lèi)病原菌之一，深入研究該菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的分子機(jī)制，不僅能更深入地認(rèn)知細(xì)菌耐藥性，同時(shí)也可為篩選藥物新靶標(biāo)、研制抗耐藥新藥提供線索和依據(jù)。 一般認(rèn)為，細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的機(jī)制主要有產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶、外膜通透性下降使藥物攝取量減少、青霉素結(jié)合蛋白突變等。但肺炎鏈球菌不產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，革蘭陽(yáng)性菌無(wú)外膜，因而膜通透性改變對(duì)肺炎鏈球菌耐藥關(guān)系不大。目前國(guó)外學(xué)者對(duì)PBPs突變引起的肺炎鏈球菌β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥性機(jī)制有較多研究，認(rèn)為肺炎鏈球菌臨床菌株pbp2B、pbp2X和pbp1A基因PBD或附近序列突變與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的相關(guān)性且有地區(qū)差異，我國(guó)學(xué)者對(duì)肺炎鏈球菌β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的流行病學(xué)調(diào)查進(jìn)行得較多，但對(duì)肺炎鏈球菌β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥性機(jī)制研究多局限于對(duì)某一個(gè)PBP編碼基因點(diǎn)突變與耐藥的關(guān)系，為確定本省耐β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素肺炎鏈球菌與PBPs突變基因多位點(diǎn)累積相關(guān)性，我們研究了36例肺炎鏈球菌臨床菌株發(fā)現(xiàn)： 4株P(guān)SSP、9株P(guān)ISP及16株P(guān)RSP菌株P(guān)BP2B中SSN的C端T445A/S突變，其余6株P(guān)SSP和1株P(guān)ISP菌株無(wú)突變。MIC≥0.5 mg/L的7株P(guān)ISP及16株P(guān)RSP菌株P(guān)BP2X中STMK出現(xiàn)T338A突變、KSG的N端出現(xiàn)L546V突變，2株P(guān)ISP菌株SSN的N端分別出現(xiàn)H394Y/L突變，另有2株高度耐藥PRSP菌株STMK的C端發(fā)生M342I突變。所有36株菌株P(guān)BP1A的SRN和KTG、10株P(guān)SSP菌株STMK序列均未發(fā)生突變，所有MIC≥1 mg/L 的PISP和PRSP菌株P(guān)BP1A的STMK均出現(xiàn)T371A/S突變、SRN的C端出現(xiàn)P432T突變。其中多個(gè)突變是未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。我們選擇了肺炎鏈球菌PBP2B、PBP2X和PBP1A三個(gè)編碼基因多位點(diǎn)突變與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥相關(guān)性進(jìn)行探討，為進(jìn)一步闡明肺炎鏈球菌β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥新機(jī)制奠定基礎(chǔ)。研究?jī)?nèi)容緊跟國(guó)際，部分領(lǐng)先國(guó)內(nèi)，具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值。

作品專(zhuān)業(yè)信息

撰寫(xiě)目的和基本思路

目的：探討SP臨床菌株pbp2B、pbp2X和pbp1A基因編碼的PBPs的PBD中SVVK、SSN和KTG基序及鄰近序列的突變與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥相關(guān)性?；舅悸罚翰捎枚断♂尫z測(cè)36株菌株對(duì)4種β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的MIC。采用PCR擴(kuò)增各菌株DNA中pbp2B、pbp2X和pbp1A基因片段并測(cè)序。根據(jù)藥敏試驗(yàn)及測(cè)序結(jié)果，分析上述基因PBD或附近序列突變與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的相關(guān)性。

科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處

科學(xué)性：利用分子生物學(xué)手段檢測(cè)了肺炎鏈球菌臨床菌株基因突變并與直接測(cè)序和藥敏試驗(yàn)對(duì)比。先進(jìn)性：基因與耐藥的相關(guān)性是近年對(duì)臨床藥物耐藥機(jī)制研究的新方法，肺炎鏈球菌臨床菌基因突變與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的相關(guān)性研究的報(bào)道不多見(jiàn)。獨(dú)特之處：國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，肺炎鏈球菌臨床菌株pbp2B、pbp2X和pbp1A基因PBD或附近序列突變與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的相關(guān)性且有地區(qū)差異。

應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義

肺炎鏈球菌是重要的人類(lèi)病原菌之一，全球每年死于肺炎鏈球菌感染約有400萬(wàn)人。β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素是臨床上治療該菌感染的一線藥物。耐藥性不斷增強(qiáng)和耐藥株的流行是該菌所致疾病發(fā)病率不斷升高的根本原因。近年來(lái)我國(guó)耐藥菌株分離率升至25%-60%研究肺炎鏈球菌pbp2B、pbp2X和pbp1A基因突變與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的相關(guān)性，為研究細(xì)菌耐藥分子機(jī)制、篩選藥物新靶標(biāo)及抗耐藥新藥的研制提供依據(jù)

學(xué)術(shù)論文摘要

目的：探討肺炎鏈球菌臨床菌株pbp2B、pbp2X和pbp1A基因突變與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥相關(guān)性。方法：采用二倍稀釋法檢測(cè)36株肺炎鏈球菌臨床菌株對(duì)4種β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的最低抑菌濃度。采用PCR擴(kuò)增各基因片段并測(cè)序。結(jié)果：36株肺炎鏈球菌臨床菌株中，10株為PSSP、10株為PISP、16株為PRSP。4株P(guān)SSP、9株P(guān)ISP及16株P(guān)RSP菌株P(guān)BP2B中SSN的C端T445A/S突變，其余6株P(guān)SSP和1株P(guān)ISP菌株無(wú)突變。MIC≥0.5 mg/L的7株P(guān)ISP及16株P(guān)RSP菌株P(guān)BP2X中STMK出現(xiàn)T338A突變、KSG的N端出現(xiàn)L546V突變，2株P(guān)ISP菌株SSN的N端分別出現(xiàn)H394Y/L突變，另有2株高度耐藥PRSP菌株STMK的C端發(fā)生M342I突變。所有36株菌株P(guān)BP1A的SRN和KTG、10株P(guān)SSP菌株STMK序列均未發(fā)生突變，所有MIC≥1 mg/L 的PISP和PRSP菌株P(guān)BP1A的STMK均出現(xiàn)T371A/S突變、SRN的C端出現(xiàn)P432T突變。結(jié)論：肺炎鏈球菌pbp2B、pbp2X和pbp1A基因突變與β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥相關(guān)

獲獎(jiǎng)情況

本論文發(fā)表于《浙江醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報(bào)》2010年第三期； 已被《中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志》錄用。

鑒定結(jié)果

本項(xiàng)目需作進(jìn)一步深入研究，目前尚無(wú)相關(guān)結(jié)論性鑒定結(jié)果

參考文獻(xiàn)

現(xiàn)有技術(shù)： 目的基因的PCR擴(kuò)增：利用PCR擴(kuò)增各菌株DNA中pbp2B、pbp2X和pbp1A基因片段。目的DNA片段測(cè)序：將上述目的DNA片段插入單鏈?zhǔn)删wM13載體，并用合成的寡聚核苷酸引物與該載體上插入待測(cè)片段的上游順序退火，隨后在T7DNA 聚合酶催化下進(jìn)行延伸反應(yīng)。同時(shí)，分別終止于A、G、C和T的4個(gè)反應(yīng)體系。每個(gè)反應(yīng)體系均含4種dNTP底物，其中一種dATP為32P標(biāo)記物，以便能用放射自顯影法讀序。 文獻(xiàn)檢索目錄： ［1］Chesnel L, Carapito R, Croizé J, et al. Identical penicillin-binding domains in penicillin-binding proteins of Streptococcus pneumoniae clinical isolates with different levels of β-lactam resistance [J]. ［2］Izdebski R, Rutschmann J, Fiett J, et al. Highly variable penicillin resistance determinants PBP 2x, PBP 2b, and PBP 1a in isolates of two Streptococcus pneumoniae clonal groups, Poland23F-16 and Poland6B-20 [J]. ［3］Cafini1 F, del Campo R, Alou L, et al. Alterations of the penicillin-binding proteins and murM alleles of clinical Streptococcus pneumoniae isolates with high-level resistance to amoxicillin in Spain[J]. ［4］Hoskins JA, Alborn WJ, Arnold J, et al. Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae strain R6 [J].

同類(lèi)課題研究水平概述

細(xì)菌耐藥性不斷增強(qiáng)及耐藥性細(xì)菌日趨流行，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康和生命安全，成為當(dāng)前全人類(lèi)共同面臨的重大醫(yī)學(xué)問(wèn)題之一。例如，最近英國(guó)、日本、印度等國(guó)家發(fā)現(xiàn)的高耐藥超級(jí)細(xì)菌（表達(dá)NDM-1 β-內(nèi)酰胺酶的腸道桿菌）感染性疾病，已成為全球矚目的焦點(diǎn)。 肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）是人類(lèi)細(xì)菌性肺炎主要病原體，也可引起細(xì)菌性腦膜炎、中耳炎等疾病。近年來(lái)，肺炎鏈球菌感染性疾病的發(fā)病率一直居高不下，全球死于肺炎鏈球菌感染的人數(shù)接近結(jié)核病，每年約為300~500 萬(wàn)人。眾所周知，β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素是臨床上治療肺炎鏈球菌等革蘭陽(yáng)性菌感染性疾病的一線藥物。業(yè)已肯定，肺炎鏈球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥性不斷增強(qiáng)及耐藥菌株廣泛流行，是該菌所致疾病發(fā)病率不斷升高的根本原因。例如，我國(guó)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥肺炎鏈球菌臨床菌株分離率，已從10年前的2%-5%上升至近年的25%-60.0%；近年來(lái)日本、韓國(guó)等周邊國(guó)家耐藥菌株分離率高達(dá)30%-70%[5]，北美和歐洲耐藥菌株分離率也可達(dá)35%-50%。因此，肺炎鏈球菌是重要的人類(lèi)病原菌之一，深入研究該菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的分子機(jī)制，不僅能更深入地認(rèn)知細(xì)菌耐藥性，同時(shí)也可為篩選藥物新靶標(biāo)、研制抗耐藥新藥提供線索和依據(jù)。 一般認(rèn)為，細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的機(jī)制主要有產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶、外膜通透性下降使藥物攝取量減少、青霉素結(jié)合蛋白突變等。但肺炎鏈球菌不產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，革蘭陽(yáng)性菌無(wú)外膜，因而膜通透性改變對(duì)肺炎鏈球菌耐藥關(guān)系不大。目前國(guó)外學(xué)者對(duì)PBPs突變引起的肺炎鏈球菌β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥性機(jī)制有較多研究，我國(guó)學(xué)者對(duì)肺炎鏈球菌β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的流行病學(xué)調(diào)查進(jìn)行得較多，但對(duì)肺炎鏈球菌β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥性機(jī)制研究多局限于對(duì)某一個(gè)PBP編碼基因點(diǎn)突變與耐藥的關(guān)系，我們閱讀國(guó)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌PBPs突變往往是通過(guò)多基因多位點(diǎn)累積突變逐步增加對(duì)抗生素的耐藥性而且不同國(guó)家與地區(qū)差異較大。為確定本省耐β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素肺炎鏈球菌與PBPs突變基因多位點(diǎn)累積相關(guān)性，我們選擇了PBP2B、PBP2X和PBP1A三個(gè)編碼基因多位點(diǎn)與肺炎鏈球菌β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥進(jìn)行探討，為進(jìn)一步闡明肺炎鏈球菌β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥新機(jī)制奠定基礎(chǔ)。研究?jī)?nèi)容緊跟國(guó)際，部分領(lǐng)先國(guó)內(nèi)，具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值。
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