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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 韋伯靈芝新漆酶基因的分離及其工程菌的構(gòu)建
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，催化的底物種類廣泛，在工業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境保護(hù)和食品加工等方面具有巨大的應(yīng)用潛力。目前阻礙漆酶商業(yè)化應(yīng)用的重要因素是缺少大量廉價(jià)的酶源供應(yīng)。因此，可通過克隆漆酶基因進(jìn)行高效率的異源表達(dá)，解決工業(yè)用漆酶供應(yīng)來源的問題。本項(xiàng)目以自主選育的具有知識產(chǎn)權(quán)且漆酶產(chǎn)量特高的靈芝菌株TZC為材料，克隆新的高效表達(dá)的漆酶基因并構(gòu)建具有高效分泌表達(dá)能力的漆酶基因工程菌。
- 詳細(xì)介紹：
- 漆酶(Laccase, EC1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，能夠氧化多種芳香化合物和其它有機(jī)化合物，并使氧氣還原生成水。漆酶催化的底物種類廣泛，因此在工業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境保護(hù)和食品加工等方面具有巨大的應(yīng)用潛力。本研究是以自主選育的具有知識產(chǎn)權(quán)且漆酶產(chǎn)量特別高的靈芝菌株TZC為實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)漆酶銅離子保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列設(shè)計(jì)一對簡并引物，通過一步法RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出1.2kb的DNA片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序驗(yàn)證后，推測為漆酶基因的部分編碼序列；接著以該部分序列為基礎(chǔ)，進(jìn)行5′-RACE和3′-RACE擴(kuò)增技術(shù)，成功分離到韋伯靈芝漆酶基因的全長DNA序列，命名為GW-lac1。該基因序列分析表明，基因長2385bp，ORF為為1566bp，編碼521個(gè)氨基酸；編碼的蛋白含有3個(gè)保守的銅離子結(jié)合域，與已知松杉樹芝(Ganoderma tsugae)的漆酶LAC1(ABK59825.1)的同源性最高為76%。為了進(jìn)一步研究GW-lac1編碼的漆酶功能，將GW-lac1編碼區(qū)（CDS）定向插入酵母表達(dá)載體pPICZ的AOX1啟動子下游，通過電激法轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115菌株中，轉(zhuǎn)化子經(jīng)博來霉素抗性和菌體直接PCR篩選，成功構(gòu)建了含有GW-lac1的基因工程酵母菌，該工程菌可進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，分離異源表達(dá)的漆酶蛋白，為有關(guān)漆酶和漆酶基因的利用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 撰寫目的：以靈芝菌株TZC為材料，克隆新的高效表達(dá)的漆酶基因并構(gòu)建具有高效分泌表達(dá)能力的漆酶基因工程菌，可以加速漆酶及其應(yīng)用的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。作品基本思路：提取TZC總RNA，設(shè)計(jì)簡并引物進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增，得到一個(gè)新漆酶基因部分編碼序列；再進(jìn)行染色體步移，獲得全長DNA序列；設(shè)計(jì)克隆引物，將新基因的編碼區(qū)克隆到畢赤酵母表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株，通過分子篩選，成功構(gòu)建異源表達(dá)載體。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 作品的科學(xué)性：實(shí)驗(yàn)方法均是基因工程領(lǐng)域近期發(fā)明的先進(jìn)克隆技術(shù)，研究結(jié)果經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切驗(yàn)證和DNA測序驗(yàn)證，可信度高。作品的先進(jìn)性：本作品是國內(nèi)外首次從食用和藥用大型真菌韋伯靈芝發(fā)酵菌絲中成功克隆到的新漆酶基因，可以向中國專利局申請新基因的專利。作品的獨(dú)特之處：以自主選育的具有知識產(chǎn)權(quán)且漆酶產(chǎn)量特別高（8,620,830 U/L）的靈芝菌株TZC為實(shí)驗(yàn)材料，其它類似作品無法復(fù)制本實(shí)驗(yàn)的成果。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 作品實(shí)際應(yīng)用價(jià)值：從具有知識產(chǎn)權(quán)且漆酶產(chǎn)量特別高的靈芝菌株出發(fā)，克隆該高產(chǎn)漆酶的基因，可以申請新漆酶基因的專利；新漆酶基因定向整合到畢赤酵母菌的基因組中，成功構(gòu)建了含有新漆酶基因的工程酵母菌，該工程菌可用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)商品漆酶，增加漆酶發(fā)酵工藝的多樣性，加速漆酶及其應(yīng)用的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。作品的現(xiàn)實(shí)意義：本作品的開展對大學(xué)生的專業(yè)學(xué)習(xí)興趣的培養(yǎng)、創(chuàng)新思維能力的訓(xùn)練以及動手實(shí)踐能力的提高都是非常重要的。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 漆酶(Laccase, EC1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，催化的底物種類廣泛，因此在工業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境保護(hù)和食品加工等方面具有巨大的應(yīng)用潛力。本研究以自主選育的具有知識產(chǎn)權(quán)且漆酶產(chǎn)量特別高的靈芝菌株TZC為實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)漆酶銅離子保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列設(shè)計(jì)一對簡并引物，通過一步法RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出1.2kb的DNA片段，推測為漆酶基因的部分編碼序列；以該部分序列為基礎(chǔ)，進(jìn)行染色體步移，成功分離到韋伯靈芝漆酶基因的全長DNA序列，命名為GW-lac1。該基因序列分析表明，基因長2385bp，ORF為為1566bp，編碼521個(gè)氨基酸；編碼的蛋白含有3個(gè)保守的銅離子結(jié)合域，與已知松杉樹芝(Ganoderma tsugae)的漆酶LAC1(ABK59825.1)的同源性最高為76%。為了進(jìn)一步研究GW-lac1編碼的漆酶功能，將GW-lac1編碼區(qū)定向插入酵母表達(dá)載體pPICZ的AOX1啟動子下游，通過電激法轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115菌株中，轉(zhuǎn)化子經(jīng)博來霉素抗性和菌體直接PCR篩選，成功構(gòu)建了含有GW-lac1的基因工程酵母菌，該工程菌可進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，分離異源表達(dá)的漆酶蛋白。
獲獎情況
- 榮獲第十二屆“挑戰(zhàn)杯”全國大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽廣州大學(xué)校賽一等獎。
鑒定結(jié)果
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”全國大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽廣州大學(xué)校賽一等獎作品。
參考文獻(xiàn)
- 1.田長恩,周玉萍,陳瓊?cè)A.一種產(chǎn)漆酶的靈芝菌株.發(fā)明專利申請?zhí)?200810198678.X 2.陳瓊?cè)A,周玉萍,畢凡星,程惠貞,田長恩.漆酶高產(chǎn)菌株的篩選.廣州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009， 7(5):53-57. 3.陳瓊?cè)A,周玉萍,陳 曉,柯德森,程惠貞,田長恩.韋伯靈芝漆酶的分離純化及其性質(zhì)研究.食品科學(xué)，2010，31(5):201-205. 4.居乃琥.酶工程研究和酶工程產(chǎn)業(yè)的新進(jìn)展（Ⅰ）— 國際酶工程研究領(lǐng)域的若干“熱點(diǎn)”和前沿課題。食品與發(fā)酵工業(yè), 2000,26:54-62. 5.居乃琥.酶工程研究和酶工程產(chǎn)業(yè)的新進(jìn)展（Ⅱ）— 國內(nèi)外酶制劑工業(yè)的現(xiàn)狀、發(fā)展趨勢和對策建議。食品與發(fā)酵工業(yè), 2000,26(4):38-62. 6.劉志明，郭麗瓊，林俊芳.真菌漆酶異源表達(dá)研究進(jìn)展. 中國生物工程雜志，2009,29(6):135-142. 7.涂寧宇,陳松明.產(chǎn)生木質(zhì)素降解酶的白腐菌的研究進(jìn)展.造紙科學(xué)與技術(shù)，2006，25:27-31. 8.趙敏，朱琳，魏巍.木腐菌氧化酶系檢定及漆酶產(chǎn)生的研究.菌物學(xué)報(bào), 2009, 28: 244-252 9.周宏敏，洪宇植，肖亞中，蒲春蕾.栓菌漆酶在畢赤酵母中高效表達(dá)及重組酶的性質(zhì).生物工程學(xué)報(bào), 2007,23:1055-1059. 10.王勇.畢赤酵母表達(dá)外源基因研究進(jìn)展.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,2004,32(1):62-66. 11.張銀波,姜瓊,江木蘭等.金針菇漆酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)研究.微生物學(xué)報(bào)，2004，44:775-779. 12.Baldrian P. Fungal laccases - occurrence and properties. FEMS Microbiol. Rev, 2006 ;30(2):215-242. 13.Riva KA, Plou F J, Ballesteros A, Alcalde M. Laccases and their applications: a patent review. Recent Pat Biotechnol, 2008, 2(1):10-24. 14.
同類課題研究水平概述
- 漆酶（Laccase，EC1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶，屬于藍(lán)色多銅氧化酶家族，能夠氧化多種芳香化合物和其它有機(jī)化合物，并使氧氣還原生成水。不同漆酶的底物的專一性不同，其利用領(lǐng)域便可能不同。因此,漆酶在紙張漂白、生物修復(fù)、染料脫色、果汁與酒的澄清和紡織品的清潔等方面都具有巨大的應(yīng)用潛力。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,漆酶基因已經(jīng)從木素降解菌和非木素降解菌中得到克隆，并且進(jìn)行了序列分析。但其編碼基因一經(jīng)克隆多申請知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)，而且漆酶產(chǎn)量低，價(jià)格昂貴，因而限制漆酶的廣泛應(yīng)用。為了解決這些問題，分離新的漆酶基因并實(shí)現(xiàn)其工程菌的高效異源表達(dá)成為了有效途徑。1990年Kojima首次將毛云芝（Coriolor hirsutus）的木素降解酚氧化酶進(jìn)行了克隆并在釀酒酵母系統(tǒng)中表達(dá)；次年Markku Saloheimo等將編碼白腐菌射脈菌（Phlebia radiata）漆酶基因克隆于黑曲霉表達(dá)系統(tǒng)中, 用纖維素酶啟動子來啟動該酶的表達(dá), 表達(dá)量為20 mg/L；另外,米曲霉和畢赤酵母系統(tǒng)也成功地表達(dá)了若干種不同來源的漆酶。但是，真正實(shí)現(xiàn)漆酶的高表達(dá)還有一定的距離。本研究所采用的實(shí)驗(yàn)材料韋伯靈芝菌株TZC在專用發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵所產(chǎn)漆酶的活性特別高（8,620,830 U/L ，ABTS法，目前已知是白腐菌中產(chǎn)量最高的菌株）。以TZC菌絲體克隆得到的新漆酶基因有利于構(gòu)建具有高效分泌表達(dá)能力的漆酶基因工程菌，為有關(guān)漆酶和漆酶基因的利用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 漆酶的應(yīng)用前景非常廣闊。隨著研究的不斷深入，人們對白腐真菌產(chǎn)酶機(jī)理、酶活性中心及作用機(jī)理都有了較多的了解。但仍存在不少問題,如菌株合成漆酶水平偏低，菌體生長較慢，酶催化效率低，不適于工業(yè)化生產(chǎn)等。因此，加強(qiáng)生物、化工、食品、農(nóng)業(yè)等多學(xué)科交叉研究開發(fā)漆酶高表達(dá)菌株，探索酶合成代謝的影響因子及其作用規(guī)律，開拓漆酶新的應(yīng)用領(lǐng)域和應(yīng)用途徑，必將具有深遠(yuǎn)的科學(xué)意義和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
